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肺炎支原體實驗室診斷研究進展

2015-12-09 15:36李冬梅
醫(yī)學(xué)理論與實踐 2015年17期
關(guān)鍵詞:支原體肺炎檢測

李冬梅

天津市河北區(qū)婦女兒童保健中心檢驗科 300142

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肺炎支原體實驗室診斷研究進展

李冬梅

天津市河北區(qū)婦女兒童保健中心檢驗科300142

摘要肺炎支原體是呼吸道感染的主要炎癥,近幾年,我國臨床實驗室對肺炎支原體的病因進行了研究,發(fā)現(xiàn)在患者的呼吸道感染中,肺炎支原體的發(fā)病率呈上升的趨勢。據(jù)統(tǒng)計資料顯示,我國的肺炎支原體患者的發(fā)病率占患有肺炎的13%~20%,其發(fā)病率以兒童多見。本文首先肺炎支原體進行概述,然后分析了肺炎支原體病變的特征,接著敘述了肺炎支原體的實驗室檢測以及診斷方法,最后根據(jù)其診斷方法進行了研究。

關(guān)鍵詞肺炎支原體實驗室診斷研究進展

目前,肺炎支原體是非典型肺炎的主要病因之一,是引起呼吸道感染的主要炎癥,兒童發(fā)病率較為常見。近幾年,成年人肺炎支原體的發(fā)病率也隨之增加,據(jù)統(tǒng)計顯示,在肺炎支原體發(fā)病率中,成年人的感染率迅速增加。但是肺炎支原體與其他病原體感染的肺炎,差別不大,并且對治療肺炎和呼吸道感染的一般藥物具有一定的耐藥性。所以,實驗室對肺炎支原體進行準確的診斷,對于治療肺炎支原體有著非常重要的意義。

1肺炎支原體概述

肺炎支原體是一種缺少細胞壁,而且在形態(tài)上具有多形性,并可以通過除菌濾器,在沒有生命的培養(yǎng)基中可以繁殖最小的原核細胞微生物,而無細胞壁只有細胞膜,呈革蘭染色陰性,形狀一般為細絲狀。支原體的黏膜作用以及免疫應(yīng)答影響著支原體的感染發(fā)病機制。支原體是通過滑行運動的方式到黏膜組織內(nèi),通常隱藏在細胞間的隱窩內(nèi),因為支原體具有特殊的結(jié)構(gòu),主要結(jié)構(gòu)有粘附因子,可以利用粘附因子粘附在細胞表面,它是一種蛋白,這種蛋白是一種免疫原,它可以促使體內(nèi)機體發(fā)生免疫應(yīng)答,是對支原體進行診斷的一種重要的抗原體。

肺炎支原體是呼吸道感染的主要炎癥,通過呼吸道飛沫進行傳播的,除了引起肺炎等呼吸道疾病之外,還可能會引起其他的并發(fā)癥,例如腦膜炎、脊髓炎、心包炎、腎炎以及腦干炎等[1]。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計分析,肺炎支原體每3~5年流行1次,主要在不同群體中流行,發(fā)病特點表現(xiàn)為間接性,而且時間長,播散緩慢,在地區(qū)中流行的時間可持續(xù)為幾個月甚至長達1年,有時候還能造成爆發(fā)性流行。全年均有發(fā)病的現(xiàn)象,但在冬季發(fā)病相對率較高。

對肺炎支原體的臨床治療可選擇:(1)對微生物蛋白質(zhì)合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行干擾和抑制;(2)在核糖體30S中,阻止肽鏈的延伸與蛋白質(zhì)的合成,對DNA復(fù)制的四環(huán)抗生素進行抑制;(3)在核酸DNA中,對其復(fù)制的喹諾酮類抗生素進行抑制[2]。

2肺炎支原體的病變

肺炎支原體的病變主要在肺部出現(xiàn),有漿液纖維素性胸膜炎變化,在胸腔中積液時會有纖維性滲出物出現(xiàn),導(dǎo)致支氣管和縱隔淋巴結(jié)腫大、充血甚至出血。據(jù)有關(guān)報道,肺炎支原體還可以導(dǎo)致體內(nèi)器官功能不全,因此應(yīng)加強對肺炎支原體的重視[3]。肺炎支原體的病變主要體現(xiàn)在心肌乏力或心包積液。其病程長的患者肺部的病變尤為明顯,表現(xiàn)為組織增生,甚至還會出現(xiàn)包囊化的壞死灶。肺炎支原體組織的病變在不同程度上會呈現(xiàn)不同的變形性顆粒與不同的脂肪變性等,肺門淋巴結(jié)甚至?xí)霈F(xiàn)反應(yīng)性的增生;皮組織有萎縮現(xiàn)象,出現(xiàn)纖維素性肺炎支原體和淋巴細胞性肺炎支原體等,這些典型的病例會呈現(xiàn)多方面的變化。

3對肺炎支原體進行實驗室檢測

3.1分離培養(yǎng)目前世界衛(wèi)生組織推薦的對支原體感染診斷的標(biāo)準方式就是培養(yǎng)肺炎支原體的分離方式。支原體的基因很小,新陳代謝能力緩慢,所以繁殖相對來講較為緩慢,每2~6h繁殖1次;其繁殖離不開葡萄糖和膽固醇;經(jīng)過重復(fù)繁殖,繁殖后形狀類似“荷包蛋”,顯示為陽性。對肺炎支原體分離采用的一般的培養(yǎng)方式,是利用痰、肺泡沖洗液、咽拭子以及胸腔積液,在培養(yǎng)基上對肺炎支原體進行分離培養(yǎng),但因為支原體沒有合成的能力,培養(yǎng)系統(tǒng)應(yīng)發(fā)揮其作用進行添加促進其合成的物質(zhì),例如脂肪醇等物質(zhì)。但是這種方式的不足點是靈敏度不高,而且培養(yǎng)的時間比較長,一般在20d左右,技術(shù)的要求性比較高,不能達到快速診斷的目的,所以在臨床中采用這種方式較少[4]。

3.2直接檢測直接檢測采用的方式一般為免疫熒光方法,先取患者呼吸道分泌物,再采用鼠抗人單克隆抗體,以及異硫氰酸熒光素對羊抗鼠標(biāo)記的抗體對支原體進行檢測,通過利用顯微鏡觀察細胞內(nèi)被標(biāo)記的支原體有沒有被感染[5]。采用這種方式方便快捷,但不足點是在臨床中還沒有找到和合適的視野,或者是未能取到感染細胞而導(dǎo)致被檢測忽略而導(dǎo)致被檢測忽略而漏檢,因而造成判斷不準確。另外,在檢測中,細胞內(nèi)的其他病原體可能會進行干擾,也會造成判斷不準確。所以這種方式因各種因素容易受到干擾,不能準確的進行判斷,而影響最終的判斷結(jié)果。

3.3基因檢測基因檢測可采用培養(yǎng)增強套式PCR法,這是PCR結(jié)合支原體檢測的方法,選取肺炎支原體患者一定量的痰液以及咽拭子,在支原體專用液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),1d后取出這些培養(yǎng)液在進行下一步的培養(yǎng),并進行兩次擴增,兩次培養(yǎng)中的反應(yīng)條件是一樣的,利用紫外檢測儀對第2次培養(yǎng)中擴增的產(chǎn)物進行觀察其結(jié)果,因為它有與陽性一樣的條帶,所以判斷為陽性。通過實驗采用以上兩種方法同本方法進行對照,陽性率分別為26.4%,26.8%和27.4%,由此可見,PCR方式不僅靈敏度準確,而且陽性率也高,但不足點是操作比較復(fù)雜,而且費時。有條件的實驗室可以采用這種方法對支原體進行檢測。采用這種方式的不足點是,由于培養(yǎng)增強套式PCR的方法由于具有敏感的特點,在對支原體進行的過程中可能會出現(xiàn)假陽性或者是假陰性的現(xiàn)象,導(dǎo)致這種現(xiàn)象的因素主要體現(xiàn)在:作為檢測的標(biāo)本已經(jīng)被污染;由于細菌的種類繁多,難免會出現(xiàn)交叉現(xiàn)象,還有就是基因的相似性,這種基因看起來很像似,但它們是不同種類,這樣對判斷會造成影響,容易誤判為陽性的結(jié)果;在實驗的標(biāo)本中存在種類繁多的蛋白,有的蛋白會阻止PCR的擴增,而導(dǎo)致漏撿的現(xiàn)象發(fā)生[6]。

3.4藥敏檢測藥物檢測可采用抗菌藥物敏感性實驗,目前關(guān)于對藥敏分析的報道相對較少,因為支原體傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法培養(yǎng)起來比較復(fù)雜,而且耗用的時間也長,對其要求相對較高[7]。近幾年,我國有臨床試驗研發(fā)了支原體的快速培養(yǎng)同藥敏結(jié)合的一種藥敏試劑盒,1~2d內(nèi)就可以出結(jié)果。這種藥敏試劑盒在對支原體進行檢測時,起了一定的作用,對于檢測支原體常用到的藥物,其中具有四類抗生素分別為:喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、林克酰胺類以及四環(huán)素類,它都可以提供,而且采用這種方法進行檢測的要求不高,不需要高端和復(fù)雜的儀器設(shè)備。通過對60例肺炎支原體患者的陽性標(biāo)本進行藥敏實驗,結(jié)果顯示,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感率中,阿奇霉素占44.3%,紅霉素占34.6%,耐藥率較高。據(jù)北京的一家醫(yī)院報道,70例肺炎支原體患者,其中大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥率達到了70%,這需要實驗室對支原體藥敏進行多次檢測[8]。支原體藥敏的檢測可以指導(dǎo)臨床合理使用抗生素,減少肺炎支原體的發(fā)生,同時還可以使耐藥株的產(chǎn)生有效減少。

4肺炎支原體的診斷方法

4.1病原學(xué)診斷病原學(xué)診斷是一種分離性培養(yǎng),是對支原體感染進行診斷的一種經(jīng)典方法,也是至今最為可靠的方法。在同一種培養(yǎng)基中,支原體的成長過程與培養(yǎng)基中血清的種類密切相關(guān),根據(jù)實驗表明,加入豬血清到培養(yǎng)基中,其生長過程最好,馬血清僅次于豬血清,最后是牛血清。在培養(yǎng)基中加入15%的馬血清,進行4~5d的培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基由原來的紅色逐漸變?yōu)辄S色,而且菌液清澈有光澤、沒有菌膜現(xiàn)象,也沒有渾濁現(xiàn)象。

染色檢查是以菌種培養(yǎng)物進行涂片,革蘭陰性,但其不足點是著色不佳,常吉母薩氏法染色。經(jīng)過甲醇進行5min的固定之后,用常吉母薩氏法染色過夜,油鏡鏡檢為:支原體菌體的顏色呈現(xiàn)為藍紫色,形狀為細小的弧狀、桿狀、球狀和絲狀以及和等典型的多中形狀。

結(jié)合小兒肺炎支原體,試驗應(yīng)用肺炎支原體被動凝集法和快速培養(yǎng)法,針對小兒支原體肺炎在不同病程中的應(yīng)用價值,經(jīng)試驗表明,被動凝集法和快速培養(yǎng)法的靈敏度分別為50.03%與83.33%,特異度分別為100%與94%,以及陽性率分別為23.3%與42.3%(P<0.05),科學(xué)合理地對檢測試劑進行慎重選擇,在對小兒肺炎支原體的臨床診斷中,肺炎支原體被動凝集法與快速培養(yǎng)法具有非常重要的意義[9]。

4.2生物學(xué)診斷在肺炎支原體感染中的應(yīng)用中,通過對比肺炎支原體抗體檢測法和熒光定量檢測法,將兩種檢測的方法進行結(jié)合,具有互補作用,可以相互間取長補短,這樣可以使肺炎支原體感染的初檢率得以提高。采用熒光定量檢測法與血清學(xué)檢測法對肺炎支原體咽拭子和血清標(biāo)本經(jīng)肺炎支原體核酸進行檢測,結(jié)果顯示,采用與血清學(xué)檢測法對肺炎支原體檢測中,其敏感性與特異性均高于血清學(xué)檢測法,由此可見,熒光定量檢測法對該病狀的診斷和治療具有重要的意義。

4.3免疫學(xué)診斷目前來看,血清學(xué)的診斷技術(shù)在臨床中的應(yīng)用相對較多,主要有間接血凝實驗、顆粒凝集法、酶聯(lián)免疫吸附法、螢火抗體實驗、直接補體結(jié)合實驗和代謝抑制試驗等方法。

試驗將酶聯(lián)免疫吸附法和顆粒凝集法對肺炎支原體進行檢測,對兩種方法的應(yīng)用價值進行評價,經(jīng)分析,顆粒凝集法對肺炎支原體進行檢測,其靈敏度與特異性均為97%,用酶聯(lián)免疫吸附法對肺炎支原體進行檢測,其靈敏度和特異性均為88%,由此可見,顆粒凝集法的敏感度與特異性均相同,說明重復(fù)性好,但不足點是操作比較復(fù)雜。

經(jīng)以上分析,通過酶聯(lián)免疫吸附法和顆粒凝集法對肺炎支原體進行檢測,發(fā)現(xiàn)兩者的陽性檢出率具有一定的差異性,酶聯(lián)免疫吸附法的陽性率呈現(xiàn)最高,為62%顆粒凝集法的陽性率為56%。酶聯(lián)免疫吸附法可同時定量檢測可進一步提高診斷率。

4.4聯(lián)合性診斷用酶聯(lián)免疫吸附法對肺炎支原體進行檢測,肺炎支原體的DNA采用聚合酶聯(lián)反應(yīng)法進行檢測,并對兩種實驗方法的效果進行分析。

采取酶聯(lián)免疫法對患者進行檢測,試驗室同時做相應(yīng)的檢測輔助診斷,并提出“肺炎支原體感染臨床診斷要結(jié)合冷凝集試驗、痰及細菌培養(yǎng)、血細胞分析以及血尿常規(guī)檢查等多項檢查進行輔助確診,避免出現(xiàn)漏診現(xiàn)象”的結(jié)論。

對患者血清中的抗體采用酶聯(lián)免疫法進行檢測,同時對感染肺炎支原體的患者進行相應(yīng)的冷凝集試驗、痰及細菌培養(yǎng)、血細胞分析以及血尿常規(guī)檢查等進行檢查[10]。為了對患者方便診斷與治療,需要對患者肺炎支原體感染進行及時檢測,另外,對于難治的肺炎支原體,做出了詳細的臨床研究,并對其做出了較為詳細的講解。

隨著人們對肺炎支原體的認識以及實驗研究的不斷深入,肺炎支原體的實驗方法也在不斷更新。肺炎支原體的實驗檢測方法有很多種,都有著一定的優(yōu)勢與不足。目前我國對肺炎支原體的實驗室檢測還沒有制定統(tǒng)一的診斷標(biāo)準,所以臨床可以根據(jù)情況選擇不同的方法進行檢測。結(jié)合本文中給出的不同方法對肺炎支原體的檢測,要利用其互補作用,需要相互補充,為臨床的早期診斷和早期治療提供有效的依據(jù)。

以上所述,對肺炎支原體的診斷方法有很多,對患者進行早期診斷與治療,可有效縮短其病程。另外,采用聯(lián)合診斷,還可以使檢測敏感度與早期診斷率明顯提高。實驗室檢測主要采用病原學(xué)診斷、生物學(xué)診斷和免疫學(xué)診斷以及聯(lián)合性診斷方法。隨著科學(xué)與醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,肺炎支原體的診斷理念逐漸由原來的二級預(yù)防轉(zhuǎn)為一級預(yù)防,可以更好地為患者服務(wù),使患者的健康質(zhì)量進一步得到保障。

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(編輯楊陽)

收稿日期2015-04-24

中圖分類號:R563.1

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1001-7585(2015)17-2305-03

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