于新友 李天芝 王 艷

(1山東綠都生物科技有限公司 山東濱州 256600 2山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 山東濱州 256600)

禽坦布蘇病毒（Avian Tembusu virus，ATMUV）可感染鴨、鵝和雞等多種禽類，引起禽坦布蘇病毒病[1]（Avian Tembusu virus disease，ATMUVD），該病自2010年在我國暴發(fā)以來，迅速波及到全國多個省份[2]，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。禽坦布蘇病毒為黃病毒科、黃病毒屬成員，引起鴨發(fā)病的病毒又稱為鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）。感染鴨群的發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率在5%～15%，臨床表現(xiàn)為高熱、蛋鴨產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降、部分感染鴨拉綠色稀便并出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。病理剖檢主要表現(xiàn)為卵巢充血、出血、萎縮和壞死，卵泡破裂，心內(nèi)膜出血，脾臟腫大。該病造成約1.2億只蛋鴨和1 500萬只肉鴨感染發(fā)病，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元[4]。本文就近年來禽坦布蘇病毒的分子生物學(xué)檢測方法研究進(jìn)展作一簡要概述，以期為該病的快速診斷和防控提供參考。

1 核酸探針

核酸探針技術(shù)是常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，它具有操作簡單，不受抗原抗體反應(yīng)的限制，結(jié)果易于判定等優(yōu)點(diǎn)，適合在基層推廣使用。高緒慧等[5]根據(jù)GenBank中Bagaza株MDTUV基因組序列設(shè)計1對特異性引物，擴(kuò)增NS3基因406bp的特異性片段，將純化的PCR產(chǎn)物用地高辛進(jìn)行探針標(biāo)記，建立了地高辛標(biāo)記探針檢測MDTUV的方法。該法敏感性高，最低檢出限量為100pg/L，特異性好，不與鴨瘟病毒、H9N2亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒和減蛋綜合征病毒的核酸發(fā)生雜交反應(yīng)。

2 RT-PCR方法

RT-PCR是以病毒的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增來檢測病毒的方法，以其簡便、迅速及靈敏等優(yōu)點(diǎn)在動物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。張帥等[6]建立了DTMUV的一步法RT-PCR檢測方法，該法具有特異、快速、敏感及準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可以檢出1.82個TCID50的病毒的核酸。李國平[7]根據(jù)GenBank上登錄的DTMUV基因組序列，設(shè)計1對引物，建立了檢測DTMUV的RT-PCR診斷方法，該法對Ⅰ型鴨肝炎病毒、新城疫病毒、減蛋綜合征病毒和鴨腸炎病毒等常見鴨病的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，檢測的敏感性達(dá)1ng RNA。張艷芳等[8]根據(jù)GenBank中DTMUV E基因和鴨圓環(huán)病毒REP基因的保守序列，設(shè)計合成了2對引物，建立了鴨坦布蘇病毒和鴨圓環(huán)病毒的二重RT-PCR方法。結(jié)果表明:該方法對鴨坦布蘇病毒和鴨圓環(huán)病毒的檢測敏感性達(dá)到100fg，對新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、番鴨細(xì)小病毒、番鴨呼腸孤病毒、H9亞型禽流感病毒和減蛋綜合征病毒的檢測結(jié)果均為陰性。趙虹等[9]針對GenBank中DTMUV NS2基因、所有亞型AIV M 基因和H9亞型AIVHA基因的保守序列，分別設(shè)計了3對特異性引物，建立可同時快速檢測DTMUV、所有亞型AIV和H9亞型AIV分型檢測的多重PCR檢測方法，并對其他鴨病病原體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性，敏感性測定結(jié)果顯示，該方法能檢測到45pg的DTMUV，7.6pg的H9亞型AIV和76pg的AIVM基因。孫敏華等[10]建立了可同時檢測DTMUV和EDSV 2種病毒的二重PCR檢測方法，特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該法可以同時檢測DTMUV和EDSV，且不與鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、番鴨呼腸孤病毒、小鵝瘟病毒、番鴨細(xì)小病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒及大腸桿菌的核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，敏感性試驗(yàn)表明，該法對DTMUV的最低檢出限為590個拷貝，對EDSV的最低檢出限為3 260個拷貝，該方法重復(fù)性良好，對不同批次的樣品擴(kuò)增效果良好。

3 套式PCR方法

套式PCR，又稱巢式PCR。使用2對PCR引物擴(kuò)增完整的片段，以第一對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪擴(kuò)增反應(yīng)，檢測的特異性更好，敏感性也更高。顏丕熙等[11]根據(jù)DTMUV E基因序列，設(shè)計了2對重疊引物P1、P2和P3、P4，建立了檢測鴨坦布蘇病毒的套式RT-PCR方法，該套式RT-PCR比一般PCR敏感性高10倍。采用該方法對安徽省、河北省、山東省、浙江省和上海市等地發(fā)病鴨場的63份樣品進(jìn)行了檢測，陽性檢出率為48/63（76.2%），而病毒分離率僅為13/63（20.6%）。黃欣梅等[12]根據(jù)GenBank發(fā)表的鵝黃病毒JS804株全基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了2對特異性引物，建立了禽黃病毒套式RT-PCR檢測方法，該法最低病毒檢測量為101.89 TCID50/0.1mL，比普通RT-PCR方法敏感性高1 000倍。

4 熒光定量RT-PCR方法

實(shí)時熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快和全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。Yan等[13]針對DTMUV E基因設(shè)計引物，建立了DTMUV TaqMan探針熒光定量RT-PCR方法，該法比常規(guī)RT-PCR敏感100倍，最低可檢測到50個拷貝的病毒核酸。Yun等[14]針對ATMUV 3′端非編碼區(qū)設(shè)計MGB探針，建立了檢測ATMUV的熒光定量RT-PCR方法，檢測時間短，2h內(nèi)即可完成檢測。萬春和等[15]根據(jù)DTMUVNS5基因序列特征設(shè)計引物，建立基于SYBRGreenⅠ檢測模式的實(shí)時熒光定量RT-PCR，該方法檢測DFV NS5基因2.74×103-2.74×107拷貝/μL，反應(yīng)范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析只出現(xiàn)1個單特異峰，無引物二聚體，Tm值為(86.23±0.18)℃，對禽流感病毒、鴨肝炎病毒、鴨源禽Ⅰ型副黏病毒、鴨減蛋綜合征病毒和番鴨呼腸孤病毒核酸均無陽性信號擴(kuò)增，可重復(fù)性好，組內(nèi)變異系數(shù)為0.52%～1.48%，組間變異系數(shù)0.71%～2.21%。彭珊等[16]建立了DTMUV的TagMan熒光定量PCR檢測方法，該法檢測敏感性是普通PCR方法的100倍，并且該方法對DTMUV的最低檢側(cè)限是0.01半數(shù)雞胚致死量(ELD50)。通過批內(nèi)和批間實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)表明優(yōu)化的熒光定量PCR方法的重復(fù)性比未優(yōu)化的熒光定量PCR方法好，該法特異性好，對其他鴨病毒核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。靳宇田等[17]根據(jù)GenBank已發(fā)表的DTMUV保守基因序列，設(shè)計了1對特異性引物及TaqMan探針，建立了檢測DTMUV的熒光定量RT-PCR方法，該法特異性好，僅能在DTMUV樣本中檢出熒光信號，與其他病原不發(fā)生交叉反應(yīng)；敏感性高，質(zhì)粒最低檢測限可達(dá)25拷貝/μL。張艷芳等[18]根據(jù)GenBank中DTMUV E基因和DPV UL6基因的保守序列，設(shè)計合成了2對引物和2條TaqMan探針，建立了同時檢測DTMUV和鴨瘟病毒的二重?zé)晒舛縍T-PCR方法。該法對DTMUV和鴨瘟病毒的檢測靈敏度均達(dá)100個模板拷貝數(shù)，同時該方法對鴨源新城疫病毒、鴨肝炎病毒、番鴨細(xì)小病毒、H9亞型禽流感病毒和減蛋綜合征病毒的檢測結(jié)果均為陰性。王楠楠等[19]根據(jù)坦布蘇病毒E基因設(shè)計1對特異性引物，建立了檢測坦布蘇病毒的SYBRGreenⅠ絕對熒光定量RT-PCR方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系顯著(r2＞0.999)，平均試驗(yàn)間變異系數(shù)為0.26%，檢測敏感性可達(dá)到2×101拷貝/μL。曾婷婷等[20]建立了可鑒別坦布蘇病毒和產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的二重實(shí)時熒光定量RT-PCR方法，該法只擴(kuò)增這2種病毒的目的片段，無交叉擴(kuò)增反應(yīng)，與其他常見禽類病原體也無擴(kuò)增反應(yīng)，該檢測體系最低可同時檢測100個拷貝的坦布蘇病毒和產(chǎn)蛋下降綜合征病毒，比常規(guī)PCR和RT-PCR敏感10～100倍。

5 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法是日本學(xué)者Notomi等發(fā)明的一項恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，特別適合在現(xiàn)場和基層應(yīng)用。Wang等建立的可視化檢測ATMUV的RT-LAMP方法在63℃水浴50min內(nèi)即可完成擴(kuò)增，敏感性達(dá)2拷貝/μL。李兆龍等[21]建立的ATMUV RT-LAMP方法在常規(guī)水浴鍋中45min內(nèi)即可完成，靈敏度達(dá)1 pg，比常規(guī)RT-PCR方法高100倍。RT-LAMP方法本質(zhì)是一種核酸擴(kuò)增檢測方法，故具有較高的敏感性與特異性，且該方法簡便、快速、無需特殊儀器設(shè)備，特別適合基層獸醫(yī)部門使用，具有廣闊的應(yīng)用前景。董嘉文等[22]根據(jù)DTMUV E基因保守區(qū)域設(shè)計了1套引物，建立了檢測DTMUV的RT-LAMP方法，該法的最低檢測限可達(dá)7.8拷貝，其靈敏度是普通RT-PCR的100倍，對其他常見鴨源病毒核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。韓凱凱等[23]建立一種基于LAMP技術(shù)的鵝源坦布蘇病毒檢測方法，該法靈敏度極高，是普通PCR方法的100倍，對于其他常見禽RNA病毒均無特異性擴(kuò)增。歐全賓等[24]根據(jù)GenBank發(fā)布的坦布蘇病毒Bagaza毒株E基因的保守序列設(shè)計1套引物，建立了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增快速檢測鴨坦布蘇病毒的方法。該法的檢測敏感性可達(dá)10拷貝/μL，對鴨坦布蘇病毒山東分離株的檢測呈陽性，而對鴨瘟病毒、禽流感病毒(H9亞型)、鴨新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒和減蛋綜合征病毒擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

6 競爭定量PCR方法

競爭定量PCR是先構(gòu)建一個與靶基因相同的擴(kuò)增效率和引物結(jié)合位點(diǎn)，僅探針結(jié)合位點(diǎn)不同的內(nèi)標(biāo)，在同一反應(yīng)管內(nèi)，靶基因和內(nèi)標(biāo)物和引物競爭性結(jié)合，進(jìn)行同步擴(kuò)增。由于競爭作用，當(dāng)一種模板量逐漸增加時，另一種模板的擴(kuò)增產(chǎn)物相對逐漸減少，但2種擴(kuò)增產(chǎn)物的比值和2種初始狀態(tài)時模板分子數(shù)的比值是一致的。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確含量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而進(jìn)行準(zhǔn)確核酸定量。袁朋等[25]建立了檢測DTMUV的競爭定量PCR方法，該法特異性強(qiáng)、靈敏性高，競爭模板和目標(biāo)模板可在400個分子/μL的水平上共擴(kuò)增，能夠滿足簡單快速確定病毒含量的要求。

7 小結(jié)與展望

雖然DTMUV分子生物學(xué)鑒別診斷方法有較多，但各有利弊，常規(guī)RT-PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高和檢出率高等特點(diǎn)，但不能準(zhǔn)確地定量、容易污染，且敏感性有限。熒光定量RT-PCR技術(shù)彌補(bǔ)了常規(guī)RT-PCR方法的缺點(diǎn)，但是熒光定量PCR儀器和探針的合成價格昂貴，檢測成本比較高，這也限制了它的普遍應(yīng)用。LAMP方法檢測快速、簡便，適合在基層獸醫(yī)和養(yǎng)殖場進(jìn)行推廣使用，但LAMP方法靈敏度高易導(dǎo)致假陽性。相信隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不久的將來，一些操作簡單、敏感高、特異性好、檢測速度快及價格低廉的DTMUV新型分子生物學(xué)檢測方法將會被建立起來。

[1]呂桂霞，裴蘋蘋.坦布蘇病毒的最新研究進(jìn)展[J].山東畜牧獸醫(yī)，2013，34（5）：79-80.

[2]Tang Y，Diao Y，Yu C，et al.Characterization of a Tembusuvirus isolated from naturally infected house sparrows （Passer domesticus）in Northern China[J].Transbound Emerg Dis，2013，60（2）：152-158.

[3]莊金秋，梅建國，王艷，等.蘇病毒實(shí)驗(yàn)室檢測方法研究進(jìn)展[J].中國家禽，2014，36（13）：41-44.

[4]朱麗萍，顏世敢.鴨坦布蘇病毒研究進(jìn)展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34(1)：79-82.

[5]高緒慧，刁有祥，唐熠探，等.針檢測鴨黃病毒的地高辛標(biāo)記DNA的制備與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2012，32（4）：525-528.

[6]張帥，云濤，葉偉成，等.鴨坦布蘇病毒一步法RT-PCR檢測方法的建立和應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，24(1)：37-40.

[7]李國平.鴨坦布蘇病毒RT-PCR診斷方法的建立與應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，10（1）：69-72.

[8]張艷芳，謝芝勛，謝麗基，等.鴨坦布蘇病毒與鴨圓環(huán)病毒二重RT-PCR方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（12）：44-47.

[9]趙虹，謝芝勛，謝麗基，等.鴨坦布蘇病毒和禽流感病毒多重PCR檢測方法的建立[J].畜牧與獸醫(yī)，2015，47（3）：90-93.

[10]孫敏華，李林林，董嘉文，等.鴨坦布蘇病毒和產(chǎn)蛋下降綜合征病毒二重PCR檢測方法的建立[J].廣東 畜 牧 獸 醫(yī) 科 技，2015，40（1）：29-31.

[11]顏丕熙，李國新，吳曉剛，等.應(yīng)用套式RT-PCR快速檢測鴨坦布蘇病毒[J].中國動物傳染病學(xué)報，2011，19(3)：34-37.

[12]黃欣梅，趙冬敏，劉宇草，等.禽黃病毒套式RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用 [J].畜牧與獸醫(yī)，2012，44(6)：5-8.

[13]Yan L P，Yan PX，Zhou JW，et al.Establishing a Taq?Man-Based Real-Time PCR Assay for the rapid detection andquantification of the newly emerged duck tembusu virus[J].JVirol，2011，8：464.

[14]Yun T，Ni Z，Hua J，et al.Development of a one-step real-time RT-PCR assay using a minor-groove-binding probe forthe detection of duck Tembusu virus[J].J Virol Methods，2012，181 （2）：148-154.

[15]萬春和，朱海俠，施少華，等.鴨坦布蘇病毒SYBRGreenⅠ實(shí)時熒光定量檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33（7）：973-978.

[16]彭珊，閏麗萍，李國新，等.鴨坦布蘇病毒TaqM an熒光定量PCR方法的優(yōu)化[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2013，35（4）：294-298.

[17]靳宇田，黃顯明，許秀梅，等.鴨坦布蘇病毒實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國動物傳染病學(xué)報，2013，21(4)：46-50.

[18]張艷芳，謝芝勛，謝麗基，等.鴨坦布蘇病毒和鴨瘟病毒二重?zé)晒舛縍T-PCR方法的建立[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（3）：77-82.

[19]王楠楠，劉芳，許漩，等.坦布蘇病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2015，45（01）：15-19.

[20]曾婷婷，謝芝勛，謝麗基，等.應(yīng)用二重實(shí)時熒光定量RT-PCR鑒別坦布蘇病毒與產(chǎn)蛋下降綜合征病毒[J].中國家禽，2015，37（1）：17-21.

[21]李兆龍，陳仕龍，林鋒強(qiáng)，等.禽新型黃病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2012，43（4）：659-663.

[22]董嘉文，孫敏華，李林林，等.實(shí)時熒光技術(shù)在鴨坦布蘇病毒RT-LAMP檢測方法中的應(yīng)用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（1）：109-112.

[23]韓凱凱，李銀不，黃欣梅，等.鵝源坦布蘇病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，26（1）：29-33.

[24]歐全賓，刁有祥，唐熠，等.鴨坦布蘇病毒E基因環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33（9）：1329-1332.

[25]袁朋，王斌，許傳田，等.鴨坦布蘇病毒競爭定量PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，47（3）：113-117.