李榮華　李瑞明

反相高效液相色譜法測(cè)定克霉唑陰道片中克霉唑的含量

李榮華1李瑞明2

目的建立克霉唑陰道片中克霉唑含量的測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法，以HYPERSIL ODS C18柱（Φ4.6 mm×250.0 mm），粒度5 μm為分析柱，磷酸氫二鉀溶液（取磷酸氫二鉀4.35 g，加水溶解并稀釋至1 000 ml）-甲醇（1:3）為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。結(jié)果克霉唑在0.1～5.0 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。r=0.9999，平均回收率為99.0%。結(jié)論本測(cè)定方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可有效測(cè)定克霉唑陰道片中克霉唑的含量。

克霉唑；陰道片；含量測(cè)定；反相高效液相色譜法

克霉唑（Clotrimazole）作為廣譜抗真菌藥物之一，其對(duì)多種真菌有抑菌作用，特別是白色念珠菌抑制效果最佳?？嗣惯蛩幚碜饔弥饕ㄟ^(guò)抑制真菌細(xì)胞膜的合成，從而抑制真菌的代謝過(guò)程，濃度較高的克霉唑亦有直接殺菌作用?？嗣惯蜿幍榔傻聡?guó)拜耳（Bayer）藥廠開(kāi)發(fā)并于20世紀(jì)90年代末在中國(guó)上市[1]?？嗣惯蛟谂R床上主要用于真菌引起的外陰陰道炎、體癬、股癬等病癥?？嗣惯蛳嚓P(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控制中主要通過(guò)非水滴定法進(jìn)行含量測(cè)定[2-3]，本文對(duì)克霉唑陰道片采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）進(jìn)行克霉唑含量測(cè)定，獲得了滿意的結(jié)果。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀為日本島津LC-10AT型，紫外檢測(cè)器為日本島津SPD-10A型，反相柱為大連依利特HYPERSIL ODS C18柱。對(duì)照品克霉唑購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0129-2002，HPLC≥99.5%。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Φ4.6 mm×250.0 mm，粒度5 μm為分析柱，柱溫采用室溫；流動(dòng)相：磷酸氫二鉀溶液（取磷酸氫二鉀4.35 g，加水溶解并稀釋至1 000 ml）-甲醇（1:3）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；丙酸睪酮與克霉唑之間的保留時(shí)間之比約為1.8，重復(fù)性試驗(yàn)RSD不得高于2.0%。

2.2溶液配制內(nèi)標(biāo)溶液制備：取丙酸睪酮對(duì)照品適量（約33 mg），置200 ml量瓶中，加流動(dòng)相150 ml超聲溶解約15 min，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。供試品溶液制備：取本品10片，研細(xì)，混勻，精密稱取適量（約相當(dāng)于克霉唑100 mg），置100 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液20 ml，加入流動(dòng)相約70 ml，超聲溶解約15 min，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻、過(guò)濾，即得。對(duì)照品溶液制備：取克霉唑?qū)φ掌愤m量（約50 mg），精密稱定，置于25 ml量瓶中，加流動(dòng)相約15 ml。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)取對(duì)照品溶液 20 μl，注入液相色譜中，記錄色譜圖，克霉唑tR約為12.3 min，丙酸睪酮tR約為20.0 min，克霉唑峰的理論塔板數(shù)為139 556，丙酸睪酮的理論塔板數(shù)為79 647（圖1）。丙酸睪酮與克霉唑之間的保留時(shí)間之比為1.7。

圖1　對(duì)照品溶液HPLC圖

2.4陰性干擾試驗(yàn)依據(jù)克霉唑陰道片處方比例，取乳糖等，按“2.2”溶液配制方法，配制空白溶液，注入液相色譜中，獲取陰性HPLC圖譜。由HPLC圖譜可知處方輔料不干擾克霉唑、丙酸睪酮的含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)圖2、3。

圖2　空白輔料溶液HPLC圖

圖3　克霉唑陰道片樣品溶液HPLC圖

2.5線性關(guān)系考察克霉唑?qū)φ掌啡芤褐瞥?2.05 mg/ml的溶液，精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，分別置于10 ml量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液2 ml，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。按本文色譜條件各進(jìn)樣20 μl測(cè)定，按外標(biāo)法以對(duì)照品克霉唑面積（A）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=2.642C－8.321，r=0.9999（n=5）。結(jié)果表明，克霉唑進(jìn)樣量在0.1～5.0 μg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次克霉唑陰道片供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件于0、2、4、6、8 h分別進(jìn)樣20 μl測(cè)定，結(jié)果峰面積的RSD為0.63%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)分別平行配制同一批制劑室自制克霉唑陰道片（批號(hào)：120508）的供試品溶液 5份，按2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，克霉唑陰道片含量的RSD為0.76%，結(jié)果表明，該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.8回收率試驗(yàn)精密稱取對(duì)照品克霉唑（含量99.5%）80 mg、100 mg、120 mg，各平行3份（共9份），置100 ml量瓶中，按克霉唑陰道片處方比例加入混合均勻的輔料，同時(shí)精密加入內(nèi)標(biāo)溶液20 ml，加入流動(dòng)相約70 ml，超聲溶解約15 min，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。按照2.5項(xiàng)下操作進(jìn)行測(cè)定。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中 C22H17ClN2的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，克霉唑陰道片含量測(cè)定方法回收率好，準(zhǔn)確度較高，見(jiàn)表1。

表1　克霉唑回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9含量限度本品處方為每片含克霉唑?yàn)?00 mg，參照USP 24版“Clotrimazole Vaginal Tablets（克霉唑陰道片）”的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將本品定為含克霉唑以（C16H19N3O5S）計(jì)應(yīng)為標(biāo)示量的93.0%～107.0%。

2.10含量測(cè)定取4個(gè)批次的克霉唑栓各10片，精密稱定，置蒸發(fā)皿中，水浴上加熱至熔化，冷卻，不停攪拌使混合均勻，精密稱取適量（約相當(dāng)于克霉唑50 mg），置100 ml量瓶中，加甲醇適量，置50 ℃水浴中振搖使克霉唑溶解，放冷至室溫，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中放置2 h，立即濾過(guò)，取續(xù)濾液放至室溫，作為供試品溶液，按本文色譜條件進(jìn)樣，見(jiàn)表2。

表2　克霉唑陰道片含量測(cè)定(以標(biāo)示量計(jì))結(jié)果(%)

3　討論

通過(guò)對(duì)克霉唑陰道片的含量測(cè)定來(lái)進(jìn)行質(zhì)量控制，以流動(dòng)相為空白，用克霉唑陰道片樣品溶液和對(duì)照品溶液在240～300 nm掃描，結(jié)果克霉唑在254 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇254 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，與文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道一致。本文對(duì)采用不同組成和比例的流動(dòng)相進(jìn)行了比較，如甲醇-磷酸氫二鉀溶液（pH 7.4，比例為3:1）、甲醇-0.1%磷酸（用三乙胺調(diào)pH 6.5，比例35:65）、如甲醇-磷酸氫二鉀溶液（pH 7.4，比例為 2:1），結(jié)果表明，以甲醇-磷酸氫二鉀溶液（pH 7.4，比例為3:1）為流動(dòng)相顯示效果最好。測(cè)量方法采用內(nèi)標(biāo)法，樣品溶液中加入內(nèi)標(biāo)物丙酸睪酮，丙酸睪酮與克霉唑之間的保留時(shí)間之比為1.8，重復(fù)性試驗(yàn)RSD低于2.0%。采用丙酸睪酮作為內(nèi)標(biāo)物的測(cè)定結(jié)果表明，該方法可排除其他成分和溶液本身顏色的干擾，且操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可有效地控制克霉唑陰道片制劑的質(zhì)量。

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Determination of Clotrimazole in Clotrimazole Virgin Tablets by RP-HPLC

Li RonghuaLi Ruiming

ObjectiveTo establish a method for determination of clotrimazole clotrimazole vaginal tablets content. MethodsUsing high performance liquid chromatography with ODS-C18column,HYPERSIL(phi 4.6 mm×250.0 mm), particle size of 5 mu m as analytical column,the solution of potassium hydrogen phosphate two(take two 4.35 G potassium hydrogen phosphate,dissolved in water and diluted to 1 000 ml)-methanol(1∶3)as mobile phase,the flow rate is 1 ml/min, the detection wavelength was 254 nm.ResultsClotrimazole in 0.1～5.0 μg/ml range has a good linear relationship. r=0.9999,the average recovery was 99.0%.ConclusionThis method was simple,accurate the content can effectively determine the Clotrimazole Vaginal Tablets in clotrimazole.

Clotrimazole;Virgin tablets;Quality determination;RP-HPLC

R927.2

A

1673-5846(2015)02-0012-03

1佛山市禪城區(qū)瀾石醫(yī)院，廣東佛山528041

2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510080

李榮華（1979.9-），本科學(xué)歷，主管藥師，藥劑科主任。主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作。E-mail：lironghua2003@163.com

李瑞明（1974-），本科學(xué)歷，主管藥師。研究方向：醫(yī)院制劑。E-mail：liruiming321@163.com