劉 勇徐浩翔惠 云張曉峰肖學(xué)敏王寶璽☆?

·論著·

人參皂苷Rg1保護(hù)UVB所致皮膚成纖維細(xì)胞急性損傷

劉 勇1☆徐浩翔2，3?惠 云4張曉峰2，3肖學(xué)敏2，3王寶璽2，3☆?

目的: 確定人參皂苷Rg1對UVB損傷成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用。方法: 體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，分為正常對照組、UVB照射組、UVB照射＋人參皂苷Rg1組(5，10和20 μg/mL)，MTT法檢測細(xì)胞增殖活性，ELISA法檢測細(xì)胞中SOD活性、MDA和細(xì)胞上清液中MMP－1和MMP－3的含量，Western blot法檢查細(xì)胞中MMP－1和MMP－3的表達(dá)。結(jié)果: UVB聯(lián)合不同濃度人參皂苷Rg1組較UVB照射組，細(xì)胞SOD活性升高，MDA、MMP－1和－3含量均有不同程度下降，人參皂苷Rg1濃度越高作用越明顯。結(jié)論: 人參皂苷Rg1對UVB造成的皮膚成纖維細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

人參皂苷Rg1； 皮膚成纖維細(xì)胞； UVB

中波紫外線(UVB)能夠到達(dá)皮膚真皮層，成纖維細(xì)胞是真皮中主要的組成細(xì)胞，也是UVB照射的靶細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，在急性光損傷過程中，UVB通過破壞DNA、激活誘導(dǎo)活性氧簇分子(reactive oxygen species，ROS)和炎癥介質(zhì)等損傷皮膚成纖維細(xì)胞，其中ROS還能促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶－1(MMP－1)和MMP－3的生成而破壞細(xì)胞外基質(zhì)加重?fù)p傷作用。人參皂苷Rg1能夠有效減輕氧化應(yīng)激作用而保護(hù)多種細(xì)胞，1，2但在UVB照射引起皮膚成纖維細(xì)胞急性損傷過程中，它是否能夠發(fā)揮保護(hù)作用的研究報(bào)道較少，所以，我們探討了人參皂苷Rg1在UVB誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養(yǎng)基和胰酶購自美國 Gibco BRL公司；胎牛血清購自北京燕生政博生物技術(shù)有限公司；人參皂苷Rg1購自中國藥品生物制品檢定所；SOD活性檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，MMP－1和MMP－3 ELISA檢測試劑盒購自美國R＆D公司，GAPDH、MMP－1和MMP－3一抗購自Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記的二抗購自Abgent公司，酶標(biāo)儀為BioTek ELX 800。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 健康青少年男子包皮環(huán)切術(shù)切除的包皮，加入0.25%胰酶消化，取出消化后的包皮組織將表皮剝離，加入PBS，將組織剪碎、吹打，離心含細(xì)胞的PBS懸液，棄上清，加入DMEM培養(yǎng)基(含10%

FBS)，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃ 5%CO2孵箱中，次日更換培養(yǎng)基。每3～4 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長融合成片達(dá)70%～80%時，進(jìn)行傳代，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞(第3～6代)用于研究。細(xì)胞分為正常對照組、UVB照射組、UVB照射＋人參皂苷Rg1組(濃度分別為5、10和20 μg/mL)，按照不同組別接受藥物和(或)照光，藥物處理組照光前24 h培養(yǎng)液中加入藥物培養(yǎng)，照光后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 UVB照射細(xì)胞 細(xì)胞生長至70%～80%融合時，棄培養(yǎng)基，用溫PBS沖洗2次，加入適量PBS，用150 mJ/cm2UVB照射，照射后立即將PBS換成培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。光源為Waldmann UV800K(德國Herbert Waldmann GmbH＆Co.) UVB照射劑量＝UVB光強(qiáng)×照光時間。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 將皮膚成纖維細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞生長至70%～80%融合時，將每孔中細(xì)胞的上清棄去，加入80 μL PBS，照射UVB，照射后立即將各孔中的PBS換成150 μL培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4 h，每孔中分別加入20 μL、5 mg/ mL MTT溶液，孵育4 h后吸除上清，各孔中加入100 μL DMSO，室溫振蕩15 min，使孔底部顆粒狀物質(zhì)溶解，酶標(biāo)儀檢測結(jié)果并分析。

1.5 細(xì)胞SOD活性和MDA含量測定 收集細(xì)胞，用冷PBS清洗并裂解，4℃離心，取部分上清測定蛋白濃度后，將上清加入試劑盒，37℃孵育20 min，使用酶標(biāo)儀測定吸光度，根據(jù)試劑盒說明書計(jì)算結(jié)果。

1.6 ELISA檢測細(xì)胞上清液中MMP－1和MMP－3含量 將細(xì)胞培養(yǎng)液加至96孔板，37℃孵育2 h，加入一抗37℃孵育1 h，洗板，加入二抗37℃孵育1 h，洗板，加入底物室溫孵育30 min，終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測結(jié)果并分析。

1.7 Western blot檢測細(xì)胞MMP－1和MMP－3表達(dá)收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩次，加適量細(xì)胞裂解液，4℃裂解細(xì)胞并收集總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取適量變性的蛋白樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至醋酸纖維素膜，PBS液洗膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS洗滌，加入一抗(濃度分別為MMP－1 1∶200，MMP－3 1∶200，GAPDH 1∶200)過夜孵育，次日二抗(1∶2000)室溫孵育，PBS洗滌，ECL發(fā)光液顯影，用熒光成像儀采集圖像并分析。設(shè)分子量為37 KD的GAPDH為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，多組間均數(shù)比較行單因素方差分析；P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg1增加UVB照射后皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性 與正常對照組相比，照射150 mJ/cm2UVB后48 h，皮膚成纖維細(xì)胞的增殖活性明顯下降至73%；UVB照射聯(lián)合人參皂苷Rg1培養(yǎng)細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞的增殖活性逐漸增強(qiáng)，UVB＋20 μg/mL人參皂甙Rg1培養(yǎng)組細(xì)胞活性上升至95%(圖1)。

圖1 UVB與不同濃度人參皂苷Rg1聯(lián)合處理對皮膚成纖維細(xì)胞活性的影響

2.2 人參皂苷Rg1增加UVB照射后皮膚成纖維細(xì)胞中SOD活性和降低MDA含量 與正常對照組相比，照射150 mJ/cm2UVB后，皮膚成纖維細(xì)胞SOD活性下降為51.5±4.7 U/mg，MDA含量升高至136.8± 13.7 μmol/mg。UVB照射聯(lián)合不同濃度人參皂甙Rg1處理細(xì)胞后，皮膚成纖維細(xì)胞的SOD活性上升，MDA含量降低，以UVB＋20 μg/mL人參皂甙Rg1培養(yǎng)組改變最明顯，SOD活性為75±5.7 U/mg，MDA含量為80.3±6.6 μmol/mg(圖2)。

2.3 人參皂苷Rg1降低UVB照射后皮膚成纖維細(xì)胞MMP－1和－3的含量 與正常對照組相比，150 mJ/cm2UVB照射后48 h，皮膚成纖維細(xì)胞胞質(zhì)和上清液中MMP－1和－3明顯增加，上清液中MMP－1和－3含量分別為76.0±11.6 ng/mL和50.7±7.4 ng/mL；UVB照射聯(lián)合人參皂甙Rg1培養(yǎng)細(xì)胞后，皮膚成纖維細(xì)胞胞質(zhì)和上清液中MMP－1和－3含量出現(xiàn)不同程度的降低，UVB＋5 μg/mL人參皂甙Rg1組上清液中MMP－1和－3分別為61.7±8.5 ng/mL和49.3±8.1 ng/mL，UVB＋10 μg/mL人參皂甙Rg1組上清液中MMP－1和－3分別為42.3±5.7 ng/mL和45.3±4.5 ng/mL，UVB＋20 μg/mL參皂甙Rg1組上清中上清液中MMP－1和－3分別為36.7±7.8 ng/mL和35.7±6.0 ng/mL(圖3)。

圖2 人參皂苷Rg1增加UVB照射皮膚成纖維細(xì)胞的SOD活性(A)和降低MDA含量(B)

圖3 人參皂苷Rg1降低UVB照射后皮膚纖維細(xì)胞MMP－1和－3的含量

4 討論

目前認(rèn)為，UVB對皮膚急性光損傷發(fā)揮著主要作用，它通過氧化作用損傷皮膚成纖維細(xì)胞，其機(jī)制為UVB引起細(xì)胞內(nèi)過氧化氫、氫氧根自由基等活性氧簇分子(ROS)的產(chǎn)生，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)破壞，影響細(xì)胞功能，造成皮膚光損傷。皮膚中的過氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的內(nèi)源性抗氧化酶，能夠?qū)筊OS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷；MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志，3其含量隨著UVB照射劑量的增加而上升。4，5人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分之一，它通過抑制一氧化氮合酶、黃嘌呤氧化酶和過氧化氫酶等多種酶活性，清除自由基，提高SOD和谷胱甘肽的活性，1，2發(fā)揮抗氧化、抗衰老的作用。在皮膚成纖維細(xì)胞急性光損傷過程中，人參皂苷Rg1是否發(fā)揮保護(hù)作用仍不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)，在UVB照射后的皮膚成纖維細(xì)胞中，人參皂苷Rg1可以改善SOD的活性，同時人參皂苷Rg1還能減輕UVB導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化，這表明人參皂苷Rg1可以降低UVB引起的皮膚成纖維細(xì)胞的氧化損傷。

ROS不僅通過氧化作用直接損傷細(xì)胞，還能通過促進(jìn)MMPs的合成而損傷皮膚細(xì)胞。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)26種MMPs，其中MMP－1和－3的作用尤為重要。研究顯示，體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)UVB照射后，細(xì)胞ROS生成增加導(dǎo)致MMP－1和－3表達(dá)增多，5，6MMP－1可水解I型和III型膠原纖維，當(dāng)這兩種膠原纖維被MMP－1切斷后，MMP－3能夠繼續(xù)降解斷裂的膠原纖維，同時MMP－3還能激活其他的基質(zhì)金屬蛋白酶，7，8從而降解真皮中的膠原纖維等多種細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致正常皮膚結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。我們研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚成纖維細(xì)胞中，人參皂苷Rg1抑制UVB誘導(dǎo)產(chǎn)生的MMP－1和－3，進(jìn)一步減輕后者引起的細(xì)胞急性光損傷。

總之，在UVB引起的皮膚成纖維細(xì)胞損傷過程中，人參皂苷Rg1通過其增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力和降

低MMP－1及－3的生成，從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，但是，人參皂苷Rg1是否通過作用于其他分子而保護(hù)細(xì)胞，仍需進(jìn)一步深入研究。

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(收稿:2014－06－23)

Protective effects of ginsenoside Rg1 against UVB－induced photo－damage on skin fibroblasts

LIU Yong，XU Hao-xiang，HUI Yun，et al.Department of Dermatology，Xinjiang Uygur Autonomous Region People’s Hospital，Urumqi，830002

Objective:To determine the protective effects of ginsenoside Rg1 against UVB－induced photodamage on skin fibroblasts.Methods:Human skin fibroblasts cultured in vitro were divided into normal control group，UVB group，UVB combined ginsenoside Rg1 groups(concentration of 5，10 and 20 μ g/mL). The proliferation activity of cells was detected by MTT assay.SOD activity，MDA and the content of MMP－1 and MMP－3 were detected by ELISA.The expression of MMP－1 and MMP－3 proteins was detected through Western blot.Results:The SOD activity in UVB combined ginsenoside Rg1 groups was higher than that in UVB group.The content of MMP－1 and MMP－3 in UVB combined ginsenoside Rg1 groups was lower than that in UVB group.The effect was dose dependent.Conclusion:Ginsenoside Rg1 can protect the dermal fibroblasts from UVB damage.

ginsenoside Rg1；dermal fibroblasts；UVB

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號:81101207，81472905)教育部高校博士點(diǎn)基金(編號:20111106120052)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金＆北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院青年基金(編號:3332013056)楊森科研基金(編號:JRCC2011－皮－01)

1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊，830002 2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，南京，210042 3江蘇省皮膚與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京，210042 4南京軍區(qū)南京總醫(yī)院皮膚科，南京，210042

☆共同第一作者

?通信作者