葛 晶王 君趙 涵王桂芝

凋亡相關(guān)蛋白在扁平苔蘚中的表達(dá)

葛 晶1王 君2?趙 涵2王桂芝2

目的: 檢測扁平苔蘚皮損中核因子κB(NF－κB)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的表達(dá)。方法:采用免疫組化法和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)檢測25例扁平苔蘚患者皮損和25例健康皮膚組織中AIF和NF－κB的積分光密度值(IOD)和角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果: 扁平苔蘚組NF－κB和AIF的積分光密度值均高于健康對(duì)照組(P＜0.01)，扁平苔蘚中角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著高于健康對(duì)照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。NF－κB的陽性表達(dá)強(qiáng)度與自身角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)不存在相關(guān)性(r＝0.13，P＞0.05)，扁平苔蘚組AIF的陽性表達(dá)強(qiáng)度與其自身的角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(r＝0.64，P＜0.01)。結(jié)論: AIF可能參與了扁平苔蘚角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。

扁平苔蘚； NF－κB； AIF； 免疫組化； 細(xì)胞凋亡

NF－κB是具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞核蛋白因子，不僅與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，而且與腫瘤形成有關(guān)。NF－κB在長期的免疫和炎癥反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用，可通過結(jié)合和編碼免疫和炎癥區(qū)域的啟動(dòng)子來影響目的基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。1曾有學(xué)者研究，在口腔扁平苔蘚皮損中，NF－κB在基底層和棘層的角質(zhì)形成細(xì)胞胞核中表達(dá)。2細(xì)胞凋亡分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑。半胱天冬氨酸蛋白酶－3(caspase－3)是外源性途徑引起細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行因子，已有大量的研究表明caspase－3參與了扁平苔蘚的形成。凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)參與內(nèi)源性線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡。3當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)后，存在于線粒體中的AIF被蛋白酶切斷后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，進(jìn)而引起染色質(zhì)凝集和DNA斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。3目前關(guān)于NF－κB和AIF在扁平苔蘚中的表達(dá)及其與凋亡的相關(guān)性研究較少，本研究旨在通過免疫組化方法檢測扁平苔蘚中NF－κB和AIF的表達(dá)情況，并檢測扁平苔蘚的凋亡指數(shù)，探討其在扁平苔蘚發(fā)病中可能存在的作用及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科2011年7月至2014年2月的扁平苔蘚患者皮損石蠟標(biāo)本25例，其中男15例，女10例。年齡31～45歲，平均37.5歲，皮損12例位于軀干，13例位于四肢，病程1～3個(gè)月。所有標(biāo)本均經(jīng)臨床醫(yī)師和專業(yè)病理醫(yī)師確診為扁平苔蘚。另取整形美容術(shù)后健康人皮膚組織25例，其中男12例，女13例，皮損11例位于軀干，14例位于四肢。年齡26～54歲，平均36歲。兩組性別、年齡及皮損取材部位差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 試劑 兔抗人NF－κB多克隆抗體，兔抗人AIF多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；通用型二抗pv－6001(北京中杉金橋)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑(北京中杉金橋)，TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(凱基生物公司)，免疫組化筆(中杉金橋)。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 將石蠟標(biāo)本切成3μm厚的切片；64℃烘烤1 h；切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水；用PH為6.0檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)2min；3%過氧化氫10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。分別滴加一抗NF－κB和AIF(滴度均為1∶70)，37℃水浴1 h，滴加通用型二抗pv－6001，37℃水浴30 min；DAB顯色1 min 15 s，蘇木素復(fù)染，脫水封片。所有步驟均用磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)沖洗3次，每次5 min。用磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照。

1.3.2 TUNEL 石蠟切片按常規(guī)方法脫蠟水合，3%過氧化氫封閉10 min，Proteinase K 37℃通透反應(yīng)30 min，DNaseI37℃處理30min，分別配制脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)液避光反應(yīng)60 min，熒光素標(biāo)記鏈酶親和素抗體反應(yīng)液和轉(zhuǎn)化劑過氧化物酶(POD)各避光反應(yīng)30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 免疫組化 NF－κB和AIF陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色，采用Image－Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)扁平苔蘚和對(duì)照組的切片進(jìn)行定量分析，測出其積分光密度值(integrated optical density，IOD)，用來表達(dá)每張切片的陽性強(qiáng)度。每張切片選取5個(gè)陽性較強(qiáng)的高倍視野(×400)，取其平均值。

1.4.2 TUNEL 凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染成棕色或棕黃色。凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)的計(jì)算:每個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)陽性高倍視野(×400)，計(jì)算出角質(zhì)形成細(xì)胞的陽性細(xì)胞數(shù)所占總細(xì)胞數(shù)的百分比，其平均值為AI。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，免疫組化和TUNEL的組間比較采用t檢驗(yàn)；NF－κB和AIF的表達(dá)強(qiáng)度與其角質(zhì)形成細(xì)胞間的凋亡指數(shù)的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果 在扁平苔蘚皮損中NF－κB和AIF陽性染色主要定位于基底層和棘層的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮乳頭層的淋巴細(xì)胞中，定位于胞質(zhì)和(或)胞核中，NF－κB在真皮乳頭層的淋巴細(xì)胞中表達(dá)顯著。而在健康對(duì)照組中僅在基底層中角質(zhì)形成細(xì)胞胞質(zhì)中呈部分陽性表達(dá)并且著色較淺。部分健康人呈陰性表達(dá)。扁平苔蘚皮損中NF－κB和AIF的表達(dá)與對(duì)照組之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) (表1，圖1)。

2.2 凋亡檢測結(jié)果 扁平苔蘚皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核著棕黃色為凋亡細(xì)胞，主要位于棘層和基底層。而健康人皮膚組織中凋亡細(xì)胞明顯減少。扁平苔蘚組和健康對(duì)照組的AI分別為41.55±23.04和17.54±7.20，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝4.97，P＜0.01)(表1，圖1)。

圖1 扁平苔蘚皮損及正常對(duì)照皮膚免疫組化

表1 扁平苔蘚組和健康對(duì)照組中NF－κB和AIF的積分光密度值(IOD)和細(xì)胞凋亡指數(shù)

2.3 相關(guān)性分析 扁平苔蘚皮損中NF－κB的陽性表達(dá)強(qiáng)度與自身角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)不存在相關(guān)性(r＝0.13，P＞0.05)，扁平苔蘚皮損中AIF的陽性表達(dá)強(qiáng)度與其自身的角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)呈正相關(guān)(r＝0.64，P＜0.01)。

3 討論

細(xì)胞凋亡亢進(jìn)是扁平苔蘚的重要形態(tài)學(xué)特征。Green曾研究表明細(xì)胞凋亡的兩條主要通路線粒體依賴性途徑和死亡受體途徑并非完全各行其道，而是在caspase－3處會(huì)合并通過caspase－3激活下游底物而呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的共同特點(diǎn)。4Abdel－Latif等5曾研究表明扁平苔蘚是依賴caspase的凋亡途徑引起細(xì)胞凋亡，但是我們的研究表明扁平苔蘚也可以依賴線粒體凋亡途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡。在本次研究中NF－κB和AIF在扁平苔蘚的基底層和棘層中均有表達(dá)，且AIF的表達(dá)情況與其自身的角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)呈正相關(guān)，由此可以推斷出AIF可能參與了扁平苔蘚的凋亡過程。而NF－κB在扁平苔蘚真皮乳頭層的淋巴細(xì)胞中仍有大量表達(dá)，表明NF－κB還可能參與了扁平苔蘚的免疫炎癥反應(yīng)。

扁平苔蘚是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的針對(duì)上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致T細(xì)胞的持續(xù)累積和上皮細(xì)胞的損傷。在以往的免疫組化實(shí)驗(yàn)中，NF－κB用于檢測組織中不同形式的慢性炎癥。非活化的NF－κB是以與IκB(κB抑制蛋白)聚合的三聚體形式存在胞漿中，當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，IκB激酶被激活，從而導(dǎo)致IκB蛋白磷酸化，泛素化，然后被降解，NF－κB二聚體得到釋放。NF－κB可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，促進(jìn)多種與免疫相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。6NF－κB參與很多癌癥的發(fā)生和發(fā)展，例如Giopanou等7在卵巢癌組織的上皮細(xì)胞中檢測到NF－κB的存在。NF－κB在腫瘤的不同發(fā)展階段有不同的作用，在G1期具有抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，而在NGM－4IM階段中，NF－κB可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和增殖。近年來，以NF－κB為藥物作用的靶向點(diǎn)，通過調(diào)節(jié)NF－κB的活性影響細(xì)胞的增殖或凋亡，來治療口腔扁平苔蘚已經(jīng)得到廣泛關(guān)注。8但是對(duì)于皮膚扁平苔蘚來說，對(duì)于針對(duì)NF－κB的藥物治療還需進(jìn)一步研究。

AIF是Susin等發(fā)現(xiàn)具有促凋亡活性的蛋白，其誘導(dǎo)非caspase依賴的細(xì)胞凋亡，AIF位于線粒體膜間隙，既具有細(xì)胞凋亡活性又具有氧化還原酶活性，但二者的作用是解偶聯(lián)的。9當(dāng)細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡，AIF裂解鈣蛋白酶然后從線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，在核中與染色體結(jié)合，導(dǎo)致非caspase依賴的染色質(zhì)凝聚，并斷裂成約50 kb的大片段，從而引起細(xì)胞凋亡。10有大量的證據(jù)表明AIF作為一種線粒體蛋白參與腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，其中Fan等經(jīng)研究表明AIF與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。11Jeong等研究發(fā)現(xiàn)在大腸癌組織中AIF的表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織。12AIF也在胃癌等其他癌癥的發(fā)展中發(fā)揮作用，但是AIF與扁平苔鮮的相關(guān)性研究未見報(bào)道。本研究表明，AIF可能參與了扁平苔蘚皮損中凋亡細(xì)胞的形成。

1 Santoro A，Majorana A，Bardellini E，et al.NF－κB expression in oral and cutaneous lichen planus.JPathol，2003，201:466－472.

2 Zhou G，Xia K，Du GF.Activation of nuclear factor－kappa B correlateswith tumor necrosis factor－alpha in oral lichen planus: a clinicopathologic study in atrophic－erosive and reticular form. JOral Pathol Med，2009，38:559－564.

3 Yuste VJ，Moubarak RE，Delettre C，et al.Cysteine protease inhibition prevents mitochondrial apoptosis inducing factor (AIF)release.Cell Death Differ，2005，12:1445－1448.

4Green DR.Apoptosis pathways paper wraps stone bluts scissor. Cell，2000，102:224－227.

5Abdel－Latif AM，Abuel－Ela HA，EI－Shourbagy SH.Increased caspase－3 and altered expression of apoptosis－associated proteins，Bcl－2 and Bax in lichen planus.Clin Exp Dermatol，2009，34(3):390－395.

6Wullaert A，Bonnet MC，Pasparakis M.NF－κB in the regulation of epithelial homeostasis and inflammation.Cell Res，2011，21(1):146－158.

7 Giopanou I，Bravou V，Papanastasopoulos P，et al.Metadherin，p50，and p65 expression in epithelial ovarian neop lasms:An immunohistochemical study.Bio Med Res Int，2014，2014: 178410.8 Rhodus NL，Cheng B，BowlesW，et a1.Proinflammatory cytokine levels in saliva before and after treatment of(erosive)oral lichen planus with dexamethasone.Oral Dis，2006，12(2):112－116.

9 Susin SA，Lorenzo HK，Zamzami N，et al.Molecular characterization ofmitochondrial apoptosis－inducing factor.Nature，1999，397:441－446.

10 Joza N，Susin SA，Daugas E，et a1.Essential role of themitechondrial apoptoois－inducing factor in programmed cell death. Nature，2001，410:549－554.

11 Fan TL，Tain F，YiS，etal.Implications of bit1 and AIF overexpressions in esophageal squamous cell carcinoma.Tomour Biol，2014，35(1):519－527.

12 Jeong EG，Lee JW，Soung YH，et al.Immunohistochem ical and mutational analysis of apoptosis－inducing factor(AIF)in colorectal carcinomas.APMIS，2006，114(12):867－873.

(收稿:2014－09－02 修回:2014－11－19)

Expression of apoptosis related protein in patientswith lichen planus

GE Jing，WANG Jun，ZHAO Han，et al.Department ofDermotology，the Affiliated Hospital ofQingdao University，Qingdao，266000

Objective:To detect the expression of nuclear factor kappa B(NF－κB)and apoptosis－inducing factor(AIF)in the patients with lichen planus(LP).M ethods:The integrated optical density and apoptosis index of NF－κB and AIF in paraffin－embedded samples of lichen planus(n＝25)and normal skin(n＝25)were detected with immunohistochemistry and term inal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nike end labeling(TUNEL).Results:The integrated optical densities of NF－κB and AIF in the LP lesions were higher than those in the control group(P＜0.01).Keratinocyte apoptosis index in the LP lesionswas significantly higher than that in the control group(P＜0.01).Therewas no correlation between the expression intensity of NF－κB and apoptosis index(P＞0.05).The expression intensity of AIFwas correlated with apoptosis index(P＜0.01).Conclusion:The expression of AIF in the lesions of lichen planusmay be involved in the cell apoptosis of keratinocytes.

lichen planus；NF－κB；AIF；immunohistochemistry；apoptosis

1青島大學(xué)，青島，266000 2青島大學(xué)附屬醫(yī)院，青島，266000?通信作者