王男男，李巖松，孟星宇，周 玉，喬 斌，孫 宇，胡 盼，盧士英，任洪林，柳增善

（人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實驗室，吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，人獸共患病研究所，吉林 長春 130062）

芴完全抗原和多克隆抗體制備與鑒定

王男男，李巖松，孟星宇，周 玉*，喬 斌，孫 宇，胡 盼，盧士英，任洪林，柳增善

（人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實驗室，吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，人獸共患病研究所，吉林 長春 130062）

以9-芴乙酸（fluorene-9-aceticacid，F(xiàn)LU）為原料，經(jīng)活性酯法合成完全抗原FLU-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和FLU-卵清白蛋白（ovalbumin，OVA），偶聯(lián)產(chǎn)物通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及紫外掃描法鑒定。使用FLU-BSA足墊免疫BALB/c小鼠獲得多克隆抗體，間接酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測得多克隆抗體效價為51 200，間接競爭ELISA方法測得芴多克隆抗體的特異性，與熒蒽的交叉反應(yīng)率為12%，與其他14 種多環(huán)芳烴交叉反應(yīng)不明顯。

9-芴乙酸；完全抗原；多克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附實驗

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指分子中含有兩個或兩個以上苯環(huán)的碳?xì)浠衔?，可分為芳香稠環(huán)型及芳香非稠環(huán)型[1]。PAHs主要由石油、煤炭、焦油等礦物燃料及其他有機(jī)物不完全燃燒產(chǎn)生[2]。一些多環(huán)芳烴類化合物已被確定具有致癌、致突變、致畸形等有害作用[3]，是受到廣泛關(guān)注的污染物之一。食品中PAHs的污染一部分來源于食品產(chǎn)地環(huán)境如大氣、水體和土壤的污染[4]，另一部分則來源于烹飪過程如油炸、熏制和燒烤等[5]產(chǎn)生的污染。多環(huán)芳烴存在于食品中，嚴(yán)重影響人類的身體健康，因此，需要建立食品中PAHs的快速靈敏的檢測方法。與傳統(tǒng)的薄層掃描法[6]等儀器分析方法相比，免疫學(xué)檢測方法以其靈敏度高、特異性強(qiáng)、前處理簡單、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)被越來越多地應(yīng)用到食品中PAHs的檢測[7]。目前國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)建立了幾種測定PAHs的間接酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法[8-9]。芴作為美國環(huán)保署規(guī)定的16 種優(yōu)先監(jiān)測的PAHs之一，目前尚未見相關(guān)免疫學(xué)檢測方法的報道。如何制備出免疫效果好的完全抗原是建立其免疫學(xué)檢測方法的關(guān)鍵性一步。芴是半抗原，相對分子質(zhì)量224.26，只具有反應(yīng)原性，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，與載體蛋白偶聯(lián)，制備完全抗原是制備芴抗體以及進(jìn)一步建立免疫學(xué)檢測方法的前提。本實驗制備了針對芴的兩種完全抗原，并制備出多克隆抗體，以期為ELISA和免疫膠體金試紙條等檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

2 只SPF級6～8 周齡雌性BALB/c小鼠，購于吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，合格證號為2011-0003，動物使用許可證號為長春生物制品研究所有限責(zé)任公司SCXK（吉）。

9-芴乙酸（fluorene-9-aceticacid，F(xiàn)LU）標(biāo)準(zhǔn)品美國Alfa公司；二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）、N-羥基琥珀酸亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS） 北京百靈威科技有限公司；雙二環(huán)己基-碳化二亞胺鹽酸鹽（N，N’-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）上海晶純生化科技股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

B S I O S電子天平 德國S a r t o r i o u s公司；MilliQPL524超純水儀 美國Millipore公司；320 pH計瑞士Mettler公司；離心機(jī) 德國Heraeus公司；移液器美國Thermo公司；IKARH BASIC磁力攪拌器 德國IKA公司；Bio-It Imaging System凝膠成像分析系統(tǒng) 美國UVP公司；U-3010紫外-可見分光光譜儀 日本Hitachi公司；Mode1680酶聯(lián)免疫檢測儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 完全抗原的制備

選取FLU為半抗原，采用活性脂法[10]制備完全抗原FLU-BSA和FLU-OVA。方法如下：稱取22.4 mg（0.2 mmol）DCC和41 mg（0.2 mmol）NHS，溶解于0.75 mL DMF中，將此混合液緩慢滴加到0.5 mL溶解了44.8 mg（0.2 mmol）FLU的DMF溶液中，邊加邊振蕩，混合液于4 ℃振蕩過夜，4 ℃、9 000 r/min低溫離心15 min，離心后上清逐滴加入到6 mL溶解了240 mg BSA或720 mg OVA的碳酸鹽緩沖液（carbonate buffer solution，CBS）緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6）中，偶聯(lián)液于4 ℃振蕩4 h后用0.01 mol/L、pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）進(jìn)行透析，每6～8 h更換一次透析液，72 h后取出于10 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清分裝后于—80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

過程載體的制備方法，除不加半抗原外，其余過程同上[11]。

1.4 完全抗原的鑒定

1.4.1 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）

對比載體蛋白、過程載體以及完全抗原在12%分離膠的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移距離的差別，分析偶聯(lián)結(jié)果[12]。

1.4.2 紫外掃描法

將過程載體以及完全抗原用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）稀釋至終質(zhì)量濃度為10 mg/mL，載體蛋白質(zhì)量濃度為8 mg/mL，以PBS做空白；將半抗原用DMF稀釋至1 mg/mL，以DMF做空白。分別對上述溶液在200～350 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，觀察特殊吸收峰的遷移變化，分析偶聯(lián)結(jié)果[13]。

1.4.3 完全抗原含量及偶聯(lián)比的測定

考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，465 nm波長處為最大吸光度，當(dāng)在稀酸條件下，可與蛋白質(zhì)結(jié)合變?yōu)榍嗌?，一定范圍?nèi)595 nm波長處的吸光度與蛋白質(zhì)含量呈正比，故可用于蛋白質(zhì)的定量檢測[14]。具體操作方法見考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒說明書。

結(jié)合1.4.2節(jié)中半抗原、載體蛋白以及完全抗原紫外掃描結(jié)果，通過朗伯-比爾定律計算出摩爾消光系數(shù)（ε），最終計算出偶聯(lián)比[15]。

式中：ε1為偶聯(lián)物在280 nm波長處的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；ε2為載體蛋白在280 nm波長處的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））；ε3為半抗原在280 nm波長處的摩爾消光系數(shù)/（L/（mol·cm））。

1.5 多克隆抗體的制備與鑒定

1.5.1 多克隆抗體的制備

本實驗共免疫2 只BALB/c小鼠。免疫程序如下：取FLU-BSA（2 mg/mL）與佐劑（首免使用弗 氏完全佐劑，非首免使用不完全佐劑）等體積混合，乳化完全后，每只小鼠足墊注射50 μL。每次免疫間隔一周，免疫4 次后，對小鼠進(jìn)行眼球采血，將采集后的血液3 000 r/min離心5 min，去除上層脂肪等物質(zhì)后即獲得多克隆抗體，保存?zhèn)溆肹16]。

1.5.2 多克隆抗體效價和特異性的鑒定

采用間接ELISA方法檢測抗血清效價[17]。具體步驟：在酶標(biāo)板內(nèi)包被FLU-OVA，每孔100 μL，4 ℃，8 h；使用磷酸鹽-吐溫緩沖液（phosphate buffered saline tween-20，PBST）清洗酶標(biāo)板3 遍，拍干；加入不同稀釋倍數(shù)的待檢血清，每孔100 μL，37 ℃，1 h；使用PBST清洗酶標(biāo)板3 遍，拍干；加入4 000 倍稀釋的羊抗鼠二抗，每孔100 μL，37 ℃，1 h；使用PBST清洗酶標(biāo)板4 遍，拍干；加入鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）底物顯色，每孔100 μL，37 ℃，10 min；加入2 mol/L濃硫酸終止，每孔50 μL；使用酶標(biāo)儀測定492 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。

采用間接競爭ELISA方法檢測多克隆抗體的特異性[18]。具體步驟：在酶標(biāo)板內(nèi)包被FLU-OVA，每孔100 μL，4 ℃，8 h；使用PBST清洗酶標(biāo)板3 遍，拍干；加入不同濃度的PAHs標(biāo)準(zhǔn)品作競爭，每孔50 μL，再加入陽性血清，每孔50 μL，37 ℃，1 h；使用PBST清洗酶標(biāo)板3 遍，拍干；加入4 000 倍稀釋的羊抗鼠二抗，每孔100 μL，37 ℃，1 h；使用PBST清洗酶標(biāo)板4 遍，拍干；加入OPD底物顯色，每孔100 μL，37 ℃，10 min；加入2 mol/L濃硫酸終止，每孔50 μL；使用酶標(biāo)儀測定492 nm波長處的OD值。以競爭濃度的對數(shù)做橫坐標(biāo)（x），以抑制率為縱坐標(biāo)（y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.301 2x—0.344 8（R2=0.997 0），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出IC50，用其余15 種優(yōu)先監(jiān)測PAHs進(jìn)行多克隆抗體特異性檢測，用交叉反應(yīng)率表示[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Native-PAGE鑒定結(jié)果

圖1 FLU-BSA完全抗原的Native-PAGE結(jié)果Fig.1 Native-PAGE of FLU-BSA

采用活性脂法制備的完全抗原，經(jīng)12% Native-PAGE鑒定。本實驗半抗原較載體蛋白相比，分子質(zhì)量較小，偶聯(lián)后的分子質(zhì)量增加不明顯，故采用非變性凝膠電泳，利用電荷影響遷移距離來判定偶聯(lián)結(jié)果，電荷的改變亦能證明偶聯(lián)成功[20]。結(jié)果如圖1所示，F(xiàn)LU-BSA完全抗原的遷移距離與BSA載體蛋白和過程載體有差異，表明完全抗原所帶電荷發(fā)生改變，由此表明，F(xiàn)LU-BSA完全抗原制備成功。同理，圖2為FLU-OVA完全抗原的鑒定。

圖2 FLU-OVA完全抗原的Native-PAGE結(jié)果Fig.2 Native-PAGE of FLU-OVA

2.2 紫外掃描法

圖3 BSA、BSA過程載體、FLU、FLU-BSA的紫外掃描結(jié)果Fig.3 Ultraviolet spectra of BSA， BSA carrier， FLU and FLU-BSA

對半抗原、載體蛋白、過程載體以及完全抗原進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果如圖3所示，BSA的紫外掃描波形在230 nm以及280 nm處存在特殊吸收峰；FLU在265 nm處存在特殊吸收峰；BSA過程載體的特殊吸收峰與BSA相比稍有偏移；而FLU-BSA則兼具載體蛋白以及半抗原的紫外掃描波形特征，在230 nm及265 nm處均存在特殊吸收峰。由此表明，F(xiàn)LU-BSA完全抗原制備成功。同理，圖4為FLU-OVA的鑒定。

圖4 OVA、OVA過程載體、FLU、FLU-OVA的紫外掃描結(jié)果Fig.4 Ultraviolet spectra of OVA， OVA carrier， FLU and FLU-OVA

2.3 完全抗原含量及偶聯(lián)比

采用考馬斯亮藍(lán)法測定完全抗原含量，以595 nm波長處的吸光度為縱坐標(biāo)（y），蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)（x，mg/mL），獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.648 3x＋0.829 6（R2=0.975 5）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出FLU-BSA和FLU-OVA的質(zhì)量濃度分別為20 mg/mL和18 mg/mL。根據(jù)圖3和圖4可知，完全抗原FLU-BSA、FLU-OVA、載體蛋白BSA、OVA和半抗原FLU在280 nm處的吸光度。根據(jù)上樣濃度可求出偶聯(lián)物FLU-BSA、FLU-OVA、載體蛋白BSA、OVA和半抗原FLU在280 nm處的摩爾消光系數(shù)。根據(jù)公式計算得出FLU-BSA和FLU-OVA的偶聯(lián)比分別為16∶1和28.5∶1（表1）。

表1 完全抗原偶聯(lián)比Table 1 Coupling ratios of complete antigens

2.4 多克隆抗體效價和特異性

圖5 ELISA法測定的1、2號小鼠多克隆抗體的效價Fig.5 Determination of polyclonal antibody titer for mice No.1 and No.2 by ELISA

通過間接ELISA對多克隆抗體進(jìn)行效價測定。根據(jù)待測孔OD492nm值/對應(yīng)陰性孔OD492nm值（P/N）≥2時，多抗的最大稀釋倍數(shù)為多抗的效價，1號和2號小鼠的效價如圖5所示，免疫4 次后，1號小鼠血清效價為21 600，低于2號小鼠血清效價51 200。故選取2號小鼠抗血清建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（1.5.2節(jié)）。通過該標(biāo)準(zhǔn)曲線測得芴的IC50為637.94 ng/mL。本實驗獲取的多抗與熒蒽的交叉反應(yīng)率為12%，與其他PAHs的交叉反應(yīng)不明顯，均小于1%（表2）。

續(xù)表2

3 討 論

如何制備出免疫效果好的完全抗原，通常由半抗原的設(shè)計與選擇、載體蛋白的選擇和偶聯(lián)方法等多方面因素決定。

3.1 半抗原的選擇

本實驗研究對象芴的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，難以與載體蛋白結(jié)合，選取半抗原時需遵循的原則包括與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)相似，要帶有易與載體蛋白結(jié)合的活性基團(tuán)，側(cè)鏈不影響半抗原電化學(xué)環(huán)境等[21]。FLU的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)簡單，其末端羧基基團(tuán)能夠與載體蛋白上的氨基反應(yīng)，側(cè)鏈長度能有效暴露芴的特征結(jié)構(gòu)供免疫細(xì)胞識別，比較適合做芴的半抗原。

3.2 載體蛋白的選擇

本實驗選取的載體蛋白BSA和OVA具備免疫活性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、廉價易得等優(yōu)點(diǎn)。且均具有較多的游離氨基，能與半抗原FLU的羧基活性基團(tuán)結(jié)合。

3.3 偶聯(lián)方法的選擇

羧基基團(tuán)與載體蛋白偶聯(lián)的常用方法主要有碳二亞胺法、混合酸酐法和活性酯法等。其中活性酯法是在碳二亞胺法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，避免了碳二亞胺直接作用于載體蛋白 而引起蛋白分子間的自身交聯(lián)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊發(fā)忠， 顏陽， 張澤志， 等. 多環(huán)芳烴研究進(jìn)展[J]. 云南化工， 2005，32(2): 44-48.

[2] 趙文昌， 程金平， 謝海贇， 等. 環(huán)境中多環(huán)芳烴(PAHs)的來源與監(jiān)測分析方法[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)， 2006， 29(3): 105-107.

[3] 聶靜， 錢巖， 段小麗， 等. 食品中多環(huán)芳烴污染的健康危害及其防治措施[J]. 環(huán)境與 可持續(xù)發(fā)展， 2009(4): 38-41.

[4] 程家麗， 黃啟飛， 魏世強(qiáng)， 等. 我國環(huán)境介質(zhì)中多環(huán)芳烴的分布及其生態(tài)風(fēng)險[J]. 環(huán)境工程學(xué)報， 2007， 1(4): 138-144.

[5] 朱小玲. 烹飪過程中多環(huán)芳烴的產(chǎn)生及控制[J]. 四川烹飪高等?？茖W(xué)校學(xué)報， 2012(5): 22-25.

[6] 厲曙光， 潘定華. 薄層掃描法測定食用油及其加熱產(chǎn)物中多環(huán)芳烴含量[J]. 衛(wèi)生研究， 1991， 20(4): 44-46.

[7] PSCHENITZA M， HACKENBERG R， NIESSNER R， et al. Analysis of benzo [a] pyrene in vegetable oils using molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE) coupled with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)[J]. Sensors， 2014， 14(6): 9720-9737.

[8] SCHARNWEBER T， FISHER M， SUCHANEK M， et al. Monoclonal antibody to polycyclic aromatic hydrocarbons based on a new benzo [a] pyrene immunogen[J]. Fresenius’ Journal of Analytical Chemistry，2001， 371(5): 578-585.

[9] KARSUNKE X Y， PSCHENITZA M， RIEGER M， et al. Screening and characterization of new monoclonal anti-benzo [a] pyrene antibodies using automat ed flow-thr ough microarray technology[J]. Journal of Immunological Methods， 2011， 371(1): 81-90.

[10] 王宇， 沈玉棟， 徐振林， 等. 氟甲哇單克隆抗體制 備， 鑒定及間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析法[J]. 分析化學(xué)， 2010， 38(3): 313-317.

[11] 張煜超， 王芳芳， 李周敏， 等. 小分子藥物人工抗原的合成與鑒定研究進(jìn)展[J]. 藥物分析雜志， 2014， 34(6): 947-951.

[12] 褚曉紅， 周玉， 李巖松， 等. 牛乳中α-酪蛋白完全抗原的合成及多克隆抗體的制備[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2014， 41(2): 75-78.

[13] 李麗華， 徐振林， 孫遠(yuǎn)明， 等. 3-氨基-2-唔唑烷酮半抗原， 人工抗原的合成及鑒定[J]. 食品工業(yè)科技， 2012， 33(2): 49-51.

[14] 王孝平， 邢樹禮. 考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量的研究[J]. 天津化工，2009(3): 40-42.

[15] 馬麗蘋. 氨芐青霉素完全抗原合成及間接競爭ELISA檢測條件的初步優(yōu)化[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘， 2013(12): 187.

[16] 郝亞明， 周玉， 盧士英， 等. 重金屬鎘單克隆抗體的制備[J]. 中國實驗診斷學(xué)， 2011， 15(5): 822-825.

[17] 宋宏新， 柏紅梅， 薛海燕， 等. 酪蛋白和乳球蛋白的抗體及酶標(biāo)物制備研究[J]. 食品科學(xué)， 2008， 29(12): 486-489.

[18] 王梅， 徐乃豐， 劉麗強(qiáng)， 等. 孔雀石綠抗原的合成及多克隆抗體的制備[J]. 食品科學(xué)， 2011， 32(7): 282-285.

[19] 金海燕. 重金屬汞多克隆抗體的制備及間接競爭ELISA方法的研究[D].大連: 遼寧師范大學(xué)， 2009.

[20] 雷紅濤， 龐杰， 賀麗蘋， 等. 半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的三種電泳鑒定方法[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 43(3): 565-570.

[21] 孫峰， 李方實. 異丙隆半抗原的制備及鑒定[J]. 南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版， 2006， 27(6): 33-36.

Preparation and Characterization of Fluorene Complete Antigen and Anti-fluorene Polyclonal Antibody

WANG Nannan， LI Yansong， MENG Xingyu， ZHOU Yu*， QIAO Bin， SUN Yu， HU Pan， LU Shiying， REN Honglin， LIU Zengshan
(Key Laboratory of Zoonosis， Ministry of Education， Institute of Zoonosis， College of Veterinary Medicine， Jilin University，Changchun 130062， China)

Fluorene-9-acetic acid (FLU) was chosen as the hapten and was coupled with bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) respectively to prepare complete antigens by active ester method. The complete antigens were characterized by native polyacrylamide gel electrophoresis and ultraviolet spectrum. FLU-BSA was used to obtain polyclonal antibody through footpad injection of BALB/c mice. The titer was 51 200 as measured by indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)， and the cross-reactivity with fluoranthene was measured by indirect competitive ELISA to be 12% while having no obvious cross-reaction with 14 other kinds of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). This ELISA method for fluorene can lay the foundation for further experimental research.

fluorene-9-acetic acid; complete antigen; polyclonal antibody; enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

TS201.6

A

1002-6630（2015）09-0108-05

10.7506/spkx1002-6630-201509020

2014-10-13

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20140101012JC）；國家自然科學(xué)基金面上項目（61171022；60971011；30771657）

王男男（1989—），女，碩士研究生，研究方向為獸醫(yī)公共衛(wèi)生。E-mail：1072274488@qq.com

*通信作者：周玉（1969—），男，教授，博士，研究方向為食品及水環(huán)境有害物質(zhì)快速檢測新方法。E-mail：zhouyu69@sina.com