尹情勝，王小董，任翠麗

(1.合肥工業(yè)大學(xué)控釋藥物研究室;2.安徽中人科技有限責(zé)任公司，安徽 合肥 230009)

聚(乳酸—乙醇酸)［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］是由乳酸(lactic acid，LA)和乙醇酸(glycolic acid，GA)聚合而成，在生物體內(nèi)可降解為內(nèi)源性物質(zhì)乳酸和乙醇酸，具有良好的生物相容性，無毒副作用，其廣泛應(yīng)用于制藥、生物工程等領(lǐng)域［1-3］。PLGA中乳酸、乙醇酸的含量既是優(yōu)化生產(chǎn)工藝、反映樣品純度的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)它們也反映PLGA在存貯期間的質(zhì)量變化和產(chǎn)品的穩(wěn)定性能。因此有必要建立靈敏的、可靠的乳酸、乙醇酸的測定方法來監(jiān)測PLGA的質(zhì)量。高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)是目前測定食品、果汁飲料、生物樣品等中乳酸、乙醇酸的較優(yōu)方法［4-6］。呂兆林等［4］用 HPLC 法測定蘋果酒中蘋果酸及乳酸的含量，黃光曉等［5］用反相高效液相色譜法測定在乙醇酸甲酯存在下的乙醇酸含量。而將HPLC法用于同時(shí)測定PLGA中微量的乳酸和乙醇酸，未見有文獻(xiàn)報(bào)道。本文建立了HPLC法測定PLGA中乙醇酸、乳酸的方法，并按照相關(guān)的技術(shù)指導(dǎo)原則［7］進(jìn)行驗(yàn)證。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-15C高效液相色譜儀，日本島津公司;TU-1901紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用公司;AE240電子天平，梅特勒公司。

1.2 材料 聚(乳酸—乙醇酸)(25/75)，安徽生建可降解聚乳酸新材料有限公司;乙醇酸、乳酸，分析純，SIGMA公司;乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純市售試劑;三氯甲烷為市售分析純;色譜柱，填料Kromasil C18，5 μm，規(guī)格 4.6 mm ×250 mm，天津蘭博公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 用十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以0.12%(v/v)磷酸溶液—乙腈(98∶2)為流動(dòng)相，流速為1.00 mL·min-1，檢測波長為210 nm，柱溫30℃。理論板數(shù)按乳酸峰計(jì)算不低于2 000。

2.2 PLGA中乳酸與乙醇酸的測定方法 精密稱取PLGA約0.1 g，加三氯甲烷4 mL溶解試樣，精密加0.12%磷酸溶液1 mL，渦旋5 min，靜置，取上清液作為供試品溶液;另取乙醇酸和乳酸適量，精密稱定，用0.12%(v/v)磷酸溶液溶解，作為對(duì)照溶液。精密量取供試溶液20μL，注入色譜儀，記錄譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中乳酸和乙醇酸的含量。

2.3 方法的專屬性 按“2.2”項(xiàng)下分別制備空白樣品、加標(biāo)樣品、供試樣品的溶液，3種樣品的色譜圖見圖1。圖1A顯示空白樣品僅含有1個(gè)小雜質(zhì)峰，圖1B顯示乳酸、乙醇酸與相鄰雜質(zhì)間兩兩完全分離，圖1C顯示供試樣品含少量的乳酸、乙醇酸。

2.4 線性與范圍 取乳酸、乙醇酸各約20 mg，精密稱定，配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定兩酸的峰面積。結(jié)果顯示乳酸、乙醇酸溶液濃度在0.5～2 000 mg·L-1時(shí)，兩酸的峰面積(A)對(duì)其濃度(C)的線性回歸方程分別為A=921C+1 099和A=807C+608，r均為 1.000 0。

2.5 方法的準(zhǔn)確度 精密稱取PLGA(含LA、GA分別為 0.036%和 0.013%)約 0.1 g，共 9 份，分成3組，各組分別定量加入LA和GA，按“2.2”項(xiàng)下方法制備成低、中、高濃度的加標(biāo)供試品溶液。按本法測定各樣品中LA、GA的量，扣除各樣中已有的LA、GA的量得回收量，結(jié)果見表1。表1顯示低、中、高濃度的加標(biāo)回收率均在96% ～101%(RSD＜1.0%，n=3)。

2.6 重復(fù)性與中間精密度考察 取PLGA約0.1 g，精密稱定，按照“2.5”準(zhǔn)確度項(xiàng)下的方法制備6份中濃度加標(biāo)供試品溶液，測定其中乙醇酸、乳酸的含量，考察方法的重復(fù)性;另一分析人員同時(shí)測定6份，考察方法的中間精密度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明方法的重復(fù)性和中間精密度均較好，RSD均小于10%，符合有關(guān)物質(zhì)分析方法的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定［9］。

2.7 方法的檢測限與定量限 分別稱取乳酸、乙醇酸適量，精密稱定，用0.12%磷酸溶液逐級(jí)稀釋成系列低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)柱分析。S/N為3時(shí)，LA、GA的濃度(即檢測限)分別為0.09和0.10 mg·L-1;在S/N約為10，LA、GA相應(yīng)的濃度為0.38和 0.36 mg·L-1，RSD 分別為 3.2% 和 3.3%(n=6)。

表1 方法的準(zhǔn)確度(加標(biāo)回收率)試驗(yàn)結(jié)果

2.8 供試溶液的穩(wěn)定性 按“2.6”項(xiàng)分別配制中 濃度加標(biāo)供試品溶液和乳酸、乙醇酸的對(duì)照溶液，分別置于4℃冰箱和室溫條件下，于1、2、3、5、7 d 時(shí)按本法測定。結(jié)果表明，乳酸和乙醇酸含量變化的絕對(duì)值在±0.1%以內(nèi)，未出現(xiàn)新的大于報(bào)告限度的雜質(zhì)，符合要求。

2.9 方法的耐用性 按“2.6”項(xiàng)分別配制中濃度加標(biāo)供試品溶液和乳酸、乙醇酸的對(duì)照溶液，在波長變化±5 nm、柱溫變化±5℃以及采用三根不同色譜柱的條件下，進(jìn)柱分析，考察本法的耐用性。結(jié)果表明，供試樣品中乳酸、乙醇酸含量測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)均小于2.0%，符合方法學(xué)驗(yàn)證要求。

2.10 供試樣品測定 取PLGA供試品3批，按照本法測定乳酸、乙醇酸的含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，供試樣品中乳酸、乙醇酸的含量極低，遠(yuǎn)小于限度要求。

表2 方法的精密度考察結(jié)果/mg

表3 3批PLGA供試品中乳酸與乙醇酸的含量

3 討論

3.1 色譜條件的確定 乳酸、乙醇酸最大吸收波長分別為210 nm和206 nm，因溶劑在低波長處有較大的吸收，對(duì)測定有干擾，選用210 nm作為檢測波長。

流動(dòng)相中用乙腈代替甲醇時(shí)，柱效較高。兩酸的p K a值分別為3.86和3.83，只有在較低pH溶液中，它們絕大部分才以分子狀態(tài)存在，峰形對(duì)稱，柱效較高。但過低的pH值易破壞色譜柱填料，故流動(dòng)相水系選擇pH1.9(0.12%磷酸溶液)。

3.2 供試樣品處理方法的優(yōu)選 三氯甲烷為PLGA的良溶劑，而乳酸、乙醇酸為水溶性的酸。故本文采用三氯甲烷將PLGA溶解，再用0.12%磷酸進(jìn)行液液萃取。

3.3 PLGA中乳酸和乙醇酸的限度 乳酸、乙醇酸是人體代謝途徑的副產(chǎn)物，屬內(nèi)源性物質(zhì)，因此，它們對(duì)人體沒有毒性。參照國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的有關(guān)PLGA的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［8］，將PLGA中乳酸與乙醇酸的限度分別設(shè)定1.5%和0.5%。

［1］李方園，姜永莉，成 穎.PLGA納米?？鼓[瘤藥物載體的研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2013，28(6):656-660.

［2］李祥偉，王麗芹，張穎麗，等.載辛伐他汀PLGA緩釋微球的制備及表征［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2013，29(3):217-220.

［3］任翠麗，尹情勝，俞 敏，等.HPLC法測定地塞米松植入劑的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(8):1294-1295.

［4］呂兆林，林 西，鄧文紅，等.HPLC法測定蘋果酒中蘋果酸及乳酸含量［J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2012，20(1):9-13.

［5］黃光曉，徐 艷，趙玉軍，等.反相高效液相色譜法測定在乙醇酸甲酯存在下的乙醇酸含量［J］.化學(xué)工業(yè)與工程，2012，29(1):48-51.

［6］馬 瑞，歐陽嘉，李 鑫，等.高效液相色譜法同時(shí)測定生物質(zhì)乳酸發(fā)酵液中有機(jī)酸及糖類化合物［J］.色譜，2012，30(1):62-66.

［7］黃曉龍.有關(guān)物質(zhì)分析方法驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)簡介［A］//國家食品藥品監(jiān)督管理局審評(píng)中心.藥品技術(shù)評(píng)價(jià)文集:第二輯.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2007:114-117.

［8］國家食品藥品監(jiān)督管理局.YBF00042009，乙交酯-丙交酯共聚物(25∶75)［S］.