吳亞文，李志紅，楊佳冰，張玉玲，李莉娟，安泓霏，王玉梅，王曉亮，張和平，張學(xué)軍，王磊

（寧夏動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川 750011）

寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

吳亞文，李志紅，楊佳冰，張玉玲，李莉娟，安泓霏，王玉梅，王曉亮，張和平，張學(xué)軍，王磊

（寧夏動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，寧夏銀川 750011）

[目的]了解寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌流行情況及主要病原菌的耐藥特征。[方法]采集寧夏地區(qū)5個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)乳樣共計(jì)461份，分離培養(yǎng)后，應(yīng)用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定并選擇主要致病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。[結(jié)果]隱性乳房炎陽(yáng)性檢出率平均為65.3%（301/461）；分離到金黃色葡萄球菌22株、無(wú)乳鏈球菌5株、大腸桿菌10株。這些細(xì)菌對(duì)阿米卡星、頭孢噻肟等藥物敏感，對(duì)青霉素與環(huán)丙沙星耐藥。[結(jié)論]寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎的陽(yáng)性率較高，主要病原菌對(duì)阿米卡星、頭孢噻肟等藥物敏感。

奶牛；隱性乳房炎；病原菌；分離；鑒定；藥敏試驗(yàn)

奶牛乳房炎為奶牛的常見(jiàn)病和多發(fā)病，是一種對(duì)乳業(yè)影響最大、危害最嚴(yán)重的常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和生鮮乳質(zhì)量安全。引起奶牛乳房炎的病原微生物包括細(xì)菌、真菌、霉形體、酵母菌、病毒等80多種，也有報(bào)道稱(chēng)多達(dá)150多種[1-2]。主要病原菌包括金黃色葡萄球菌（SA）、無(wú)乳鏈球菌（SAG）、大腸桿菌（CO）、其他鏈球菌（OS，或環(huán)境性鏈球菌ES）等；次要病原菌包括凝固酶陰性葡萄球菌（CNS）、牛棒狀桿菌（CB）及其他細(xì)菌（OTH）等[2-5]。盡管奶牛規(guī)?；B(yǎng)殖越來(lái)越大，管理越來(lái)越規(guī)范，奶牛各種疾病，尤其是乳房炎發(fā)病率已成下降趨勢(shì)，但在一些中、小規(guī)模牛場(chǎng)和建場(chǎng)比較早的一些牛場(chǎng)，奶牛乳房炎，尤其是隱性乳房炎的發(fā)病率依然居高不下。臨床發(fā)現(xiàn)

的奶牛乳房炎多為隱性病例，多數(shù)臨床性乳房炎病例都是由隱性病例發(fā)展而來(lái)。由于隱性乳房炎造成不易察覺(jué)的產(chǎn)奶量隱性損失，常被忽視，且極易轉(zhuǎn)為臨床型乳房炎，帶來(lái)更大的損失。因此，及時(shí)了解和掌握引起寧夏地區(qū)奶牛乳房炎發(fā)病的病原微生物的流行病學(xué)特點(diǎn)，對(duì)預(yù)防和治療隱性乳房炎有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 待檢材料

以寧夏地區(qū)5個(gè)規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)泌乳奶牛（飼養(yǎng)規(guī)模均為500-600頭）為調(diào)查和研究對(duì)象，5個(gè)牛場(chǎng)分別采集非臨床性乳房炎乳樣118份、89份、89份、100份和65份。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR清潔級(jí)小鼠84只，體重約18-25g，購(gòu)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

無(wú)菌采集乳樣（每頭牛四個(gè)乳區(qū)乳樣混合），樣品采集后標(biāo)明耳標(biāo)號(hào)、日期，將取樣試管放在試管架上，放置裝有冰塊的便攜式冷藏箱中盡快送往實(shí)驗(yàn)室。

1.4 儀器與設(shè)備

無(wú)菌操作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（美國(guó)BD公司生產(chǎn)，型號(hào)為BD2011）等。

1.5 材料與試劑

5%綿羊血液瓊脂（購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；Baird Parker培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、革蘭氏染液、3%過(guò)氧化氫及1∶4兔血漿（1ml兔血漿加入3ml滅菌生理鹽水）（寧夏動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室自制）；BD鑒定肉湯管、BD藥敏肉湯管、BD藥敏指示劑、BD鏈球菌藥敏指示劑、BD革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌與鏈球菌鑒定藥敏符合板（購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司）。

1.6 細(xì)菌的分離與純化

將乳樣分別用無(wú)菌涂抹棒涂布于5%綿羊血液瓊脂、BP培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂的1/2區(qū)域上，3個(gè)平行。放入37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～48h，觀察菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落涂片、革蘭氏染色并鏡檢，初步判定染色特性和形狀。

1.7 動(dòng)物接種試驗(yàn)

周岱翰曾治療過(guò)兩個(gè)同時(shí)查出肝癌的患者。其中一個(gè)到美國(guó)進(jìn)行肝移植，另一個(gè)由他進(jìn)行中藥調(diào)理。半年后，兩人在美國(guó)見(jiàn)面。肝移植的病人大哭不止，因?yàn)橐浦埠笏麕缀醣煌耆O(jiān)護(hù)，開(kāi)口怕吃錯(cuò)，動(dòng)手怕做錯(cuò)，過(guò)得生不如死。而另一個(gè)病人在感覺(jué)癥狀減輕后便攜妻子周游世界。288天后，肝移植病人在痛苦中死去了。雖然另一人一年后也過(guò)世了，但在他生命最后的日子里，活得很滋潤(rùn)，走得沒(méi)有遺憾。

為了減少下一實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)需要鑒定細(xì)菌的數(shù)量，進(jìn)行動(dòng)物接種試驗(yàn)，選擇有致病力的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。用滅菌注射器吸取上述各種純化菌株的37℃ 24h肉湯培養(yǎng)物，腹腔注射健康小鼠，每只0.5ml，實(shí)驗(yàn)組每種菌接種3只小鼠。隨機(jī)選取3只小白鼠，腹腔注射無(wú)菌肉湯0.5ml作為對(duì)照。觀察2d左右，記錄結(jié)果。

1.8 細(xì)菌的鑒定與藥敏試驗(yàn)

結(jié)合上述動(dòng)物接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果，挑取能使小白鼠發(fā)病的細(xì)菌純培養(yǎng)的菌落（同類(lèi)型的主要病原菌每種選5株）接種于細(xì)菌鑒定儀的細(xì)菌鑒定藥敏復(fù)合板上，進(jìn)行鑒定，隨后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。革蘭氏陽(yáng)性菌接種于革蘭氏陽(yáng)性菌鑒定藥敏復(fù)合板、革蘭氏陰性菌接種于革蘭氏陰性菌鑒定藥敏復(fù)合板，鏈球菌接種于鏈球菌鑒定藥敏復(fù)合板。培養(yǎng)37℃ 10～12 h后，讀取全自動(dòng)細(xì)菌儀上的結(jié)果。

由于鑒定儀不能詳細(xì)地區(qū)分葡萄球菌屬的各種細(xì)菌，要進(jìn)一步在Baird Parker培養(yǎng)基上培養(yǎng)葡萄球菌，觀察菌落形態(tài)特征，通過(guò)進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)及血漿凝固酶試驗(yàn)鑒定細(xì)菌的種類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離與純化

乳樣初培養(yǎng)后，24h觀察一次，48h再觀察一次。5個(gè)奶牛場(chǎng)乳樣病原菌檢出率培養(yǎng)結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。細(xì)菌染色、鏡檢可見(jiàn)細(xì)菌既有革蘭氏陽(yáng)性菌又有革蘭氏陰性菌，可見(jiàn)葡萄串樣細(xì)菌、桿狀細(xì)菌和鏈狀細(xì)菌。

表1 5個(gè)牛場(chǎng)乳樣中隱性乳房炎病原菌檢出率

2.2 動(dòng)物試驗(yàn)

小鼠接種后，有56只在24～48h內(nèi)均表現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀，并開(kāi)始死亡，其他小鼠僅表現(xiàn)短期精神沉郁。剖檢發(fā)病及死亡小鼠，多見(jiàn)肺淤血，肝臟被膜有出血點(diǎn)，腸管漿膜出血、臌氣等病理現(xiàn)象。做病變器官的組織觸片、染色鏡檢，均可見(jiàn)與相應(yīng)接種菌形態(tài)相似、染色特性一致的細(xì)菌。對(duì)照組3只小白鼠精神狀態(tài)良好，無(wú)異常癥狀。

2.3 細(xì)菌鑒定

2.3.1 乳樣中病原菌的分離率。結(jié)合儀器鑒定結(jié)果，隨后對(duì)葡萄球菌屬的細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。在Baird Parker培養(yǎng)基形成圓形、隆起、灰色或黑色周?chē)鷰С恋砭€(xiàn)的菌落且接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性、血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性的細(xì)菌，鑒定為金黃色葡萄球菌；血漿凝固酶試驗(yàn)陰性的細(xì)菌，鑒定為凝固酶葡萄球菌。5個(gè)奶牛場(chǎng)乳樣中病原菌的鑒定情況分別見(jiàn)表2。

2.3.2 乳樣中的主要病原菌。動(dòng)物試驗(yàn)中使小鼠表現(xiàn)出臨床癥狀及死亡的細(xì)菌說(shuō)明其有一定的致病性，按照臨床經(jīng)驗(yàn)作為主要病原菌單獨(dú)列表如下（表3）。

表3 5個(gè)牛場(chǎng)乳樣中主要病原菌分離鑒定結(jié)果

通過(guò)5個(gè)奶牛場(chǎng)461份乳樣細(xì)菌培養(yǎng)分離鑒定的情況分析，本次調(diào)查中引起寧夏地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌是金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌（73%），低于郭海勇報(bào)道主要病原菌占細(xì)菌總數(shù)83.33%[6]。金黃色葡萄球菌是優(yōu)勢(shì)菌，與相關(guān)報(bào)道一致。這種狀況必然會(huì)導(dǎo)致我區(qū)生鮮乳體細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)菌計(jì)數(shù)水平升高，生鮮乳質(zhì)量安全隱患較大。

2.4 藥敏試驗(yàn)的結(jié)果

通過(guò)對(duì)全自動(dòng)細(xì)菌儀藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)得知：金黃色葡萄球菌對(duì)阿米卡星、頭孢噻肟、慶大霉素與復(fù)方磺胺敏感，對(duì)青霉素與環(huán)丙沙星耐藥；無(wú)乳鏈球菌對(duì)阿米卡星、頭孢噻肟、頭孢吡肟、阿莫西林藥物敏感，對(duì)克林霉素、氯霉素與四環(huán)素耐藥；大腸桿菌對(duì)阿米卡星與頭孢噻肟敏感，對(duì)頭孢唑啉、氨芐西林耐藥。

3 討論與小結(jié)

5個(gè)牛場(chǎng)奶牛隱性乳房炎主要病原菌中金黃色葡萄球菌分離率相對(duì)較高。金黃色葡萄球菌是定植于乳腺的傳染性病原微生物，較難防治。切斷傳播途徑是防止本病發(fā)生的有效措施，如擠奶器的消毒，擠奶人員衛(wèi)生意識(shí)的提高等。大腸桿菌，無(wú)乳鏈球菌是環(huán)境性病原微生物，這類(lèi)病原菌常寄生在牛體表及周?chē)h(huán)境中。因此，搞好奶牛場(chǎng)的飼養(yǎng)管理，環(huán)境消毒，牛舍、牛床地面的清潔，糞便的及時(shí)處理，擠奶衛(wèi)生等措施尤為重要。在夏季時(shí)，應(yīng)注意消滅蚊蠅，保持牛體清潔，牛舍通風(fēng)，以減少或避免大規(guī)模發(fā)生乳房炎。

5個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)奶牛病原菌感染率平均達(dá)65.3%，與郭海勇報(bào)道感染率為65.63%基本一致[6]，普遍高于奶業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家牛群乳房炎50%的防控指標(biāo)，稍高于劉東軍報(bào)道的62.7%[7]；檢出了各牛場(chǎng)隱性傳染性乳房炎感染牛，特別是危害較大的金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌感染牛，金黃色葡萄球菌平均分離率為4.8%，有2個(gè)牛場(chǎng)即1場(chǎng)和2場(chǎng)金黃色葡萄球菌分離率達(dá)6.7%以上，接近于日本牛

群金黃色葡萄球菌乳房炎7%的防控指標(biāo)。從細(xì)菌的分離率結(jié)果可知凝固酶陰性葡萄球菌（53.4%）、金黃色葡萄球菌（4.8%）、牛棒狀桿菌（4.6%）、其他鏈球菌（3.0%）、大腸桿菌（2.2%）、無(wú)乳鏈球菌（1.1%、）其他細(xì)菌（1.3%）分別依次為我區(qū)奶牛乳房炎常見(jiàn)致病菌。凝固酶陰性葡萄球、牛棒狀桿菌的高檢出率表明我區(qū)擠奶程序、擠奶技術(shù)和擠奶衛(wèi)生消毒管理還不夠規(guī)范。雖說(shuō)是次要病原菌，但也應(yīng)引起養(yǎng)殖戶(hù)的高度重視，以免導(dǎo)致更多臨床型乳房炎的發(fā)生。

主要致病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明細(xì)菌對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星已產(chǎn)生耐藥性；對(duì)阿米卡星、頭孢噻肟藥物敏感，建議臨床可以使用。不同地區(qū)奶牛乳房炎病原菌對(duì)抗生素的敏感性呈現(xiàn)較大的差異，除了血清型的地區(qū)性差異這一原因外，抗生素的大量使用也是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性差異的直接原因，應(yīng)引起各奶牛場(chǎng)的足夠重視。

因此，牛場(chǎng)應(yīng)采取措施提高奶牛免疫力，強(qiáng)化擠乳衛(wèi)生要求，提高飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，以減少健康牛發(fā)生隱性乳房炎；選擇有效的預(yù)防和治療藥物防止隱性乳房炎轉(zhuǎn)為臨床型乳房炎，從而避免重大經(jīng)濟(jì)損失的出現(xiàn)，仍然是奶牛乳房炎防控的要點(diǎn)。

[1]魏小娟，蒲萬(wàn)霞，周緒正，等.蘭州地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，28（8）：113-114.

[2]烏倫吉如嘎，郭志凱，鄧常勝，等.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].畜牧與飼料科學(xué)，2012，33（10）：114-115.

[3]鄧海平，俞詩(shī)源，王玲，等.內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（2）：595-596+598.

[4]張珠明，汪仁莉，何生虎.吳忠市奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，（17）：307-308.

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[6]郭海勇，韓國(guó)華，崔京春.大連地區(qū)奶牛隱性乳房炎主要病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2011，38（9）：163-166.

[7]劉東軍.新疆石河子地區(qū)隱形乳房炎病原菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2009，34（4）：22-23.

Isolation and Identifi cation of Subclinical Mastitis Pathogens and Drug Sensitivity Tests in Dairy Cows in Ningxia Autonomous Region

Wu Yawen，Li Zhihong，Yang Jiabing，Zhang Yuling，Li Lijuan，An Hongfei，Wang Yumei，Wang Xiaoliang，Zhang Heping，Zhang Xuejun，Wang Lei
（Ningxia Center for Animal Disease Control and Prevention，Yinchuan，Ningxia 750011）

[Objective] To clarify the species and distribution of cow sub-mastitis pathogens in Ningxia Hui Autonomous Region and identify the antimicrobial resistance of the main pathogens. [Method] 461 milk samples were collected from dairy cows with subclinical mastitis in five dairy farms for isolation and identification of pathogenic bacteria. Identification and drug sensitivity tests of the prominent pathogens were conducted by means of automatic bacteria identification equipment. [Result] The results indicated that the positive rate in the sub-mastitis cows was 65.3%（301/461）. Three pathogenic bacteria were isolated，including 22 Staphylococcus aureus strains，5 Streptococcus agalactiae strains and 10 Escherichia coli strains. These bacteria were resistant to penicillin and ciprofloxacin，but all showed susceptibility to cefotaxime and amikacin. [Conclusion] Pathogens isolated and identified in this experiment were susceptible to cefotaxime and amikacin.

dairy cow；sub-mastitis；bacteria；isolation；identification；drug sensitivity test

S858.23

A

1005-944X（2015）03-0004-04

寧夏回族自治區(qū)科技支撐項(xiàng)目（2013ZZN30）

張和平