蔣文明，莊青葉，王素春，李金平，侯廣宇，陳繼明

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

山東省雞傳染性法氏囊病流行現(xiàn)狀及病毒特性

蔣文明，莊青葉，王素春，李金平，侯廣宇，陳繼明

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

用RT-PCR方法對(duì)山東省疑似傳染性法氏囊?。↖BD）組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行了病毒分離，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出分離病毒的全基因組。譜系分析表明，除WF株外，其他分離株與國(guó)內(nèi)大部分強(qiáng)毒株位于同一個(gè)譜系。序列分析表明，LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN分離株VP2七肽基序均為S-W-S-A-S-G-S，在第222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸殘基分別是A、Q、I、D、A、I和S，具有IBDV強(qiáng)毒的分子特征。攻毒試驗(yàn)表明，LY株產(chǎn)生明顯IBD病變，死亡率為40%（2/5），為強(qiáng)毒株，結(jié)果與序列分析一致。WF株與B87和Gt疫苗株位于同一譜系，VP2分子特征也與Gt弱毒株相同，攻毒試驗(yàn)顯示W(wǎng)F株為弱毒株。同源性分析表明，LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN與國(guó)內(nèi)分離的強(qiáng)毒株之間VP2氨基酸序列的同源性為93.3%～99.8%，與現(xiàn)行商品疫苗毒株B87和Gt的VP2氨基酸序列同源性分別為94.1～96.2%和94.5～96.9%；WF分離株與國(guó)內(nèi)分離株之間VP2氨基酸同源性為95.6%～99.2%，與疫苗株B87和Gt株VP2氨基酸同源性分別為99.2%和99.6%。本文對(duì)山東省流行的雞傳染性法氏囊病毒進(jìn)行了分子流行病學(xué)分析，對(duì)病毒的基因組學(xué)和致病性進(jìn)行了初步研究，此研究對(duì)了解本病的流行現(xiàn)狀，分析病毒變異規(guī)律具有重要意義。

傳染性法氏囊??；RT-PCR；基因組；VP2蛋白

傳染性法氏囊?。↖BD）又稱甘布羅病（Gumboro disease），由雙股RNA病毒科、禽雙股RNA病毒屬的傳染性法氏囊病病毒（IBDV）引起。雖然火雞、鴨、珍珠雞和鴕鳥均可感染IBDV，但僅雞臨床上發(fā)病，且僅損害幼雞。該病不但致染病動(dòng)物死亡，還導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，使機(jī)體的免疫防御能力降低和疫苗免疫接種失敗。

IBDV基因組包括A、B兩個(gè)片段，編碼5種病毒蛋白：VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。VP1由B片段編碼，為病毒自身編碼的依賴RNA的RNA聚合酶。其他4種病毒蛋白由A片段編碼的多聚蛋白加工而成：VP2和VP3是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒衣殼，VP4為病毒自身蛋白酶，VP5的功能尚不明確。VP2是病毒的主要保護(hù)性抗原，具有血清型特異性，已經(jīng)鑒定的中和表位主要在VP2上，并且均為構(gòu)象依賴性[1-3]。此外，VP2還與病毒的毒力和細(xì)胞嗜性有關(guān)[4]。

20世紀(jì)80年代中后期，在世界范圍內(nèi)暴發(fā)了在抗原性和致病性等方面與經(jīng)典毒株有很大差異的IBDV變異毒株（包括超強(qiáng)毒株，vvIBDV）導(dǎo)致的IBD，使養(yǎng)雞業(yè)遭受了重創(chuàng)[5]。變異株和vvIBDV的出現(xiàn)使該病的防控難度加大，IBD免疫失敗已成為禽病防控的重要問(wèn)題[6]。因此，進(jìn)一步分析當(dāng)前流行的IBDV分子遺傳變異特征對(duì)研制新型IBD疫苗、提高IBDV免疫防控效果具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。國(guó)內(nèi)外對(duì)IBDV的分子流行病學(xué)分析主要是針對(duì)VP2基因，為此，作者對(duì)山東省當(dāng)前流行的IBDV進(jìn)行了分離和全基因組測(cè)序，并進(jìn)一步分析了VP2基因的分子特征，對(duì)IBDV的流行現(xiàn)狀進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

病料來(lái)自2013-2014年山東省臨沂、濰坊、青島、濱州、聊城、泰安、德州、菏澤、濟(jì)寧等地區(qū)發(fā)生疑似傳染性法氏囊病的雞場(chǎng)，采集發(fā)病雞的法氏囊組織，研磨凍融，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

QIAamp Viral RNA Mini Kit購(gòu)自Qiagen公司，HiScript II One Step RT-PCR Kit購(gòu)自Vazyme公司，TOPO克隆試劑盒購(gòu)自Clone Smarter公司。

1.3 傳染性法氏囊病毒核酸檢測(cè)

1.3.1 引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank中發(fā)表的IBDV基因組序列，利用MEGA軟件進(jìn)行比對(duì)，在SA片段保守區(qū)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，序列如下：P1，5′-GAGATCAGACAAACGATCGCAGC-3′，P2，5′-TCTGTCAGTTCACTCAGGCTTCC-3′。預(yù)期片段大小437bp。引物由寶生物工程有限公司合成。

1.3.2 RT-PCR。根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說(shuō)明提取病料中病毒的RNA。RT-PCR反應(yīng)根據(jù)HiScript II One Step RT-PCR Kit說(shuō)明書進(jìn)行操作。在PCR反應(yīng)管中依次加入ddH2O 6.25μL，2×Buffer 12.5μL，引物P1、P2（10pmol/L）各1.0μL，Enzyme Mix 1.25μL，最后加入模板RNA 3.0μL。RT-PCR反應(yīng)條件如下：50℃ 30min，94℃ 2min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94℃ 30s，55℃30s，72℃30s），最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 病毒分離

樣品研磨凍融后，經(jīng)0.22μm孔徑的濾器過(guò)濾除菌后，經(jīng)絨毛尿囊膜接種9～11日齡SPF雞胚，每個(gè)雞胚接種0.2mL樣品。具體接種方法如下：分別在雞胚無(wú)血管處和氣室頂端打一小孔，用吸球在氣室頂端孔處抽吸以制造人工氣室，然后用注射器于雞胚無(wú)血管處接毒，之后將所打孔用蠟封閉，繼續(xù)孵化。每日照蛋，接種48h內(nèi)死亡的雞胚棄去不用。收集接種48h后死亡雞胚，檢查雞胚病變。對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行IBDV的RT-PCR檢測(cè)。

1.5 傳染性法氏囊病毒全基因組擴(kuò)增

1.5.1 引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank中發(fā)表的IBDV基因組序列，利用MEGA軟件進(jìn)行比對(duì)，分別在A、B片段保守區(qū)設(shè)計(jì)中間引物，對(duì)A、B片段進(jìn)行分段擴(kuò)增。引物由寶生物工程有限公司合成（表1）。

1.5.2 RT-PCR。RT-PCR反應(yīng)根據(jù)HiScript II One Step RT-PCR Kit說(shuō)明書進(jìn)行操作。反應(yīng)體系同1.3.2。RT-PCR反應(yīng)條件如下：50℃ 30min，94℃2min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（94℃ 30s，55℃30s，72℃120s），最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，利用DNA膠回收試劑盒純化回收，然后與TOPO載體連接，陽(yáng)性重組質(zhì)粒送生工生物測(cè)序鑒定。

表1 擴(kuò)增IBDV全基因組引物

1.6 序列分析

將測(cè)得的序列進(jìn)行拼接，獲得完整的基因組序列（A和B片段）。利用ClustalW軟件分別與GenBank中發(fā)表的IBDV基因組序列進(jìn)行對(duì)比，再用MEGA5.2軟件對(duì)序列進(jìn)行譜系分析。譜系分析的參數(shù)設(shè)置如下：采用Neighbor-joining計(jì)算方法，核苷酸變異設(shè)為Kimura 2-parameter模式，各位點(diǎn)變異速率設(shè)為Gamma分布（Gamma參數(shù)為2.0）。Bootstrap值的計(jì)算設(shè)置為1000個(gè)重復(fù)。

1.7 VP2基因分析

用DNAStar軟件對(duì)本研究中分離毒株的VP2序列和GenBank中發(fā)表的所有IBDV的VP2序列進(jìn)行分析，并利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行譜系分析。

1.8 病毒毒力鑒定

選取LY和WF分離株，以105 EID50 IBDV對(duì)3周齡的SPF雞進(jìn)行滴眼攻毒，0.1 mL/只，每組5只，觀察臨床癥狀和病變。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

對(duì)從山東臨沂、濰坊等地區(qū)發(fā)生疑似傳染性法氏囊病的雞場(chǎng)采集的發(fā)病雞法氏囊組織進(jìn)行RTPCR檢測(cè)，擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的條帶（圖1），說(shuō)明這些發(fā)病雞感染了傳染性法氏囊病毒。

2.2 病毒分離

圖1 疑似傳染性法氏囊病組織RT-PCR檢測(cè)

樣品經(jīng)絨毛尿囊膜接種SPF雞胚后引起部分雞胚死亡。病變主要表現(xiàn)為萎縮、皮下水腫、充血，皮下或顱內(nèi)出血，肝臟腫大、不均勻的充血、呈致斑駁病變。晚死的雞胚表現(xiàn)肝腫大、變綠、有壞死灶；脾腫大，腎水腫、充血，呈斑紋狀。分離毒株分別命名為L(zhǎng)Y、WF、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN。

2.3 全基因組擴(kuò)增與序列分析

通過(guò)分段擴(kuò)增的方法，獲得了傳染性法氏囊病毒9個(gè)分離株的全基因組。根據(jù)靴攀值（bootstrap）和核苷酸差異（bootstrap ≥ 60和核苷酸差異 > 2%劃分為一個(gè)分支；核苷酸差異 < 2%為一個(gè)亞分支）進(jìn)行譜系分析。結(jié)果表明，A基因片段可以劃分為A1、A2、A3三個(gè)大的譜系，A1又可進(jìn)一步細(xì)分為A1.1和A1.2兩個(gè)小分支，近年來(lái)分離的強(qiáng)毒株主要分布在A1.1分支，本研究中分離的LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN也屬于此分支；A3可進(jìn)一步細(xì)分為A3.1、A3.2和A3.3三個(gè)小分支，其中A3.3包含了B87和Gt疫苗株，本研究中分離的WF也屬于此分支。B基因片段可以劃分為B1、B2、B3三個(gè)大的譜系，B1又可進(jìn)一步細(xì)分為B1.1和B1.2兩個(gè)小分支，近年來(lái)分離的強(qiáng)毒株主要屬于B1.1分支，本研究中分離的LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN也屬于此分支。B2分支包含了B87和Gt疫苗株，本研究中分離的WF也屬于此分支（圖2）。

2.4 VP2序列分析

圖2 IBDV全基因組譜系分析

圖3 IBDV VP2基因譜系分析

LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN分離株VP2蛋白的七肽基序?yàn)镾-WS-A-S-G-S，而WF分離株的VP2七肽基序?yàn)镾-W-S-A-R-G-S，與弱毒Gt疫苗株相同。LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN分離株在第222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸殘基分別為A、Q、I、D、A、I和S，這些氨基酸殘基是IBDV具有致病性的特征氨基酸殘基，而WF分離株在這些位點(diǎn)的氨基酸殘基分別為P、H、V、N、T、L和N，與弱毒Gt疫苗株相同。根據(jù)致病性IBDV的VP2基因分子標(biāo)志判斷，LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN分離株具備IBDV強(qiáng)毒株的分子特征，而WF分離株具備IBDV弱毒株的分子特征。

譜系分析表明，VP2可以劃分為6個(gè)分支，本研究中分離的LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN與大部分強(qiáng)毒分離株屬于VP2.6分支，WF分離株與B87和Gt疫苗株同屬于VP2.3分支（圖3）。本研究中分離的LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN與 國(guó) 內(nèi)分離的強(qiáng)毒株之間VP2氨基酸序列的同源性為93.3%～99.8%，與現(xiàn)行商品疫苗毒株B87和Gt的VP2氨基酸序列同源性分別為94.1%～96.2%和94.5%～96.9%；WF分離株與國(guó)內(nèi)分離株之間VP2氨基酸同源性為95.6%～99.2%，與疫苗株B87和Gt株VP2氨基酸同源性分別為99.2%和99.6%。

2.5 分離株的毒力

將分離毒對(duì)SPF雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，LY組在攻毒后第2d出現(xiàn)明顯食欲減退和精神萎靡癥狀，在第3d死亡2只；尸體剖檢見法氏囊組織水腫和出血，腺胃與肌胃交界處出血，腿肌、胸肌有條索狀出血。用1.3中RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為陽(yáng)性。根據(jù)OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》的定義，LY株為強(qiáng)毒力IBDV。WF組在攻毒后幾乎不引起臨床癥狀、沒(méi)有雞的死亡，法氏囊出現(xiàn)了輕微的水

腫病變，為低毒力IBDV。

3 討論

隨著IBDV變異毒株（包括超強(qiáng)毒株）的不斷出現(xiàn)，不但引起患病雞死亡，還導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制，使機(jī)體的免疫防御能力降低和疫苗免疫接種失敗，從而繼發(fā)和并發(fā)其他疾病，致使養(yǎng)雞業(yè)經(jīng)濟(jì)損失加劇。

我們從山東省疑似IBD發(fā)病雞中分離到9株IBDV，并進(jìn)行了基因組測(cè)序和分析，譜系分析表明大部分分離株與國(guó)內(nèi)近年來(lái)分離的毒株屬于同一個(gè)譜系，說(shuō)明它們之間的親緣關(guān)系很近。

VP2蛋白與病毒的致病性、免疫保護(hù)抗原表位有關(guān)，因此研究VP2蛋白變異狀況對(duì)提高IBD疫苗的免疫防控效果具有重要意義。VP2蛋白分為保守區(qū)和高變區(qū)兩部分，不同毒株之間的基因變異大多數(shù)發(fā)生在高變區(qū)。VP2蛋白高變區(qū)有1個(gè)重要結(jié)構(gòu)：七肽基序S-W-S-A-S-G-S（第326～332位氨基酸殘基）[2，6]。VP2蛋白高變區(qū)的七肽基序和特征性氨基酸被認(rèn)為是強(qiáng)毒株或超強(qiáng)毒株在衍化過(guò)程中的分子標(biāo)記[6，7]。研究發(fā)現(xiàn)，七肽基序在強(qiáng)毒株中是唯一保守的，這個(gè)富集絲氨酸基序所形成的氫鍵參與對(duì)毒力至關(guān)重要的分子內(nèi)或分子間相互作用[2]。

研究表明，IBDV強(qiáng)毒株和超強(qiáng)毒株在VP2蛋白的A222、Q253、I256、D279、A284、I294和 S299是高度保守的[8-11]。其中，Q253、D279和A284除與細(xì)胞的毒力有關(guān)外，還與細(xì)胞嗜性有關(guān)[8，9]。雖然IBDV的毒力、細(xì)胞嗜性和致病型等分子特征仍然需要深入研究，但從迄今已報(bào)道的結(jié)果可以看出，VP2蛋白七肽基序以及一些特征氨基酸殘基是致病性IBDV的重要分子標(biāo)記。

本研究對(duì)近期山東省分離的IBDV VP2蛋白進(jìn)行了序列分析，除WF株外，其他分離株的七肽基序均為S-W-S-A-S-G-S，在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸殘基分別是A、Q、I、D、A、I和S。根據(jù)有關(guān)致病性IBDV的VP2蛋白分子標(biāo)志判斷，LY、QD、BZ、LC、TA、DZ、HZ、JN具備IBDV強(qiáng)毒株的分子特征。選取LY株對(duì)3周齡雛雞進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，可使其產(chǎn)生典型的IBD病變和死亡。結(jié)合臨床癥狀、病理變化、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，判定LY為IBDV強(qiáng)毒株。同源性分析發(fā)現(xiàn)，山東省分離株與國(guó)內(nèi)分離株VP2氨基酸同源性為93.3%～99.8%，與現(xiàn)行商品疫苗毒株B87和Gt的VP2氨基酸序列同源性分別為94.1%～96.2%和94.5%～96.9%。

本研究中分離的WF株七肽基序和222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸殘基，與弱毒Gt疫苗株相同，SPF雞攻毒試驗(yàn)也表明WF為弱毒株。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，分離WF病毒的雞群未使用Gt疫苗進(jìn)行免疫。從基因組序列來(lái)看，WF株的A片段與Gt疫苗株的核苷酸同源性為99.6%，有11個(gè)堿基不同，其中有1處缺失；WF株的B片段與Gt疫苗株的核苷酸同源性為99.9%，有3個(gè)堿基不同；其中VP2與Gt疫苗株的核苷酸同源性為99.6%，有6個(gè)堿基不同，其中有1處連續(xù)3個(gè)堿基不同。因此，判斷WF為自然弱毒株，而非Gt疫苗株。

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Epidemic Situation and Virus Characteristics of Infectious Bursal Disease in Shandong province

Jiang Wenming，Zhuang Qingye，Wang Suchun，Li Jinping，Hou Guangyu，Chen Jiming
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Tissue samples with suspected infectious bursal disease（IBD）from Shandong province were detected by RT-PCR method，and viruses were isolated from the positive samples. The whole genomes of isolates were amplified with designed primers. Phylogenetic analysis showed that these isolates except WF strain belonged to the same lineage with most virulent strains in the country. Sequence analysis showed that VP2 seven-peptide motif of LY，QD，BZ，LC，TA，DZ，and HZ isolates were S-W-S-A-S-G-S，and amino acid residues at positions 253，253，256，256，284，294 and 299 were A，Q，I，D，A，I and S respectively，with molecular characteristics of virulent IBDV. Challenge test showed that LY strain induced obvious IBD lesions，mortality was 40%（2/5），referred as virulent IBDV，which was consistent with the sequence analysis. WF strain and vaccine strains B87 and Gt belonged to the same lineage，their VP2 molecular features were same as the Gt attenuated strain，and challenge experiments showed WF strain as attenuated IBDV. Sequences analysis indicated that the homology of amino acid sequences of VP2 of LY，QD，BZ，LC，TA，DZ，and HZ isolates and other virulent strains in the country was 93.3% ～ 99.8%，while with the vaccine strains B87 and Gt were 94.1 ～ 96.2% and 94.5 ～ 96.9% respectively. The homology of amino acid sequences of VP2 of between WF isolate and other isolates was 95.6% ～ 99.2%，and with the vaccine strains B87 and Gt were 99.2% and 99.6% respectively. In this paper，molecular epidemiology of chicken infectious bursal virus was analyzed in Shandong province，and genomics and pathogenicity of the virus were studied preliminarily. It is of great significance to understand the epidemic situation and analysis of the virus variation.

infectious bursal disease；RT-PCR；genome；VP2 protein

S852.65

A

1005-944X（2015）03-0011-06