梁 軒，劉 毅

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

犬弓首蛔蟲線粒體cox1基因的克隆及序列分析

梁 軒，劉 毅

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

本研究旨在闡明我國犬弓首蛔蟲（Toxocara canis）湖南分離株線粒體細(xì)胞色素c氧化酶第I亞基（cox1）基因部分序列（pcox1）的遺傳變異情況，并用其與其它弓首蛔蟲的pcox1序列構(gòu)建進(jìn)化關(guān)系。應(yīng)用PCR擴(kuò)增犬弓首蛔蟲蟲株的pcox1，將所獲得的序列應(yīng)用Mafft 7.122程序進(jìn)行比對，然后用PhyML 3.1程序ML法繪制種系發(fā)育樹。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增所獲得的pcox1序列長度一致，均為394 bp，種內(nèi)變異在0～2.5%之間，種間差異為8.2%～11.6%。種系發(fā)育分析結(jié)果表明，12個(gè)犬弓首蛔蟲分離株位于同一分支。由于犬弓首蛔蟲pcox1序列種內(nèi)相對保守，種間差異較大，故可作為種間鑒定檢測研究的遺傳標(biāo)記，本研究結(jié)果為犬弓首蛔蟲的分類、鑒定和群體遺傳結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

犬弓首蛔蟲；線粒體DNA；cox1基因；種系發(fā)育關(guān)系

犬弓首蛔蟲是世界性分布的寄生蟲線蟲，主要感染犬和其他犬科動(dòng)物，可引起犬弓首蛔蟲病。據(jù)調(diào)查，國外犬弓首蛔蟲感染率為5.5%～64.7%[1-2]；我國中西部地區(qū)犬的感染率較高，而東部地區(qū)犬的感染率相對較低[3-4]。弓首蛔蟲卵在感染非特異性宿主后（包括人），其幼蟲可以長期在組織器官中移行，可引起內(nèi)臟幼蟲移行癥（VLM）、眼睛幼蟲移行癥（OLM）和非化膿性腦膜腦炎等，導(dǎo)致嚴(yán)重的病理綜合癥[5-6]。因此，正確鑒定蛔蟲種類，不僅具有重要學(xué)術(shù)價(jià)值，而且對預(yù)防和控制該病也具有重要意義。

一些研究表明：使用核糖體DNA（rDNA）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS-1和ITS-2）序列作為分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確鑒定犬弓首蛔蟲、貓弓首蛔蟲和獅弓首蛔蟲[7-8]。但Blouin認(rèn)為，利用線粒體DNA（mtDNA）

的線粒體cox1基因作為遺傳標(biāo)記來鑒定線蟲種，尤其是隱藏種更為有效[9]。線粒體DNA 作為胞核外遺傳物質(zhì)具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快、母性遺傳、無組織特異性等特點(diǎn)，是研究寄生蟲分子分類、群體遺傳、系統(tǒng)進(jìn)化的一種很好的分子標(biāo)記[10]。線粒體cox1基因作遺傳標(biāo)記對其他蛔蟲（比如人、豬蛔蟲）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生、群體遺傳研究、蟲種及蟲株鑒定已有較多報(bào)道[11-13]，但對弓首蛔蟲的研究報(bào)道則相對較少[14]。

本研究以從湖南不同地區(qū)犬采集的犬弓首蛔蟲作為研究對象，PCR擴(kuò)增其線粒體線粒體細(xì)胞色素c氧化酶第I亞基（cox1）基因部分序列（pcox1）并進(jìn)行分析，從而明確犬弓首蛔蟲線粒體cox1基因部分序列能否成為理想的種間遺傳標(biāo)記，旨在為今后犬弓首蛔蟲的分類、鑒別診斷及本病的防制等更深入的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣品

本試驗(yàn)研究的11條犬弓首蛔蟲樣品采自湖南省益陽市，具體信息見表1。

表1 本試驗(yàn)所用犬弓首蛔蟲樣品

1.2 主要試劑

rTaq酶 及 PCR試 劑（Buffer、MgCl2、dNTPs）購自大連寶生物公司；蛋白酶K購自Merck公 司；TIANamp Genomic DNA Kit購 自Tiangen公司。

1.3 樣品DNA的制備

從70%的酒精保存液中取單個(gè)蟲體，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3次后，置于一新的1.5 mL Eppendorf管中，用滅菌的微型剪刀將蟲體組織剪碎，加入200μL GA Buffer反復(fù)研磨，再加20μL蛋白酶K，混勻后，置60 ℃恒溫水浴箱消化1～3 h（每30 min混勻一次）。消化好的蟲體懸液按TIANamp Genomic DNA Kit使用說明進(jìn)行蟲體DNA提取，DNA樣品分裝后置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增

采 用 引 物JB3和JB4.5[15]來 擴(kuò) 增 犬 弓首蛔蟲線粒體pcox1，引物序列為JB3：'-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3'；JB4.5：'-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3'， 引 物由海生工生物科技有限公司合成。擴(kuò)增體系為25μL：雙蒸水14.25μL、10×PCR Buffer 2.5μL、MgCl2（25 mmol/L）3μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2μL、上下游引物（50 pmol/μL）各0.5μL、rTaq酶（5 U/μL）0.25μL、模板DNA 2μL。反應(yīng)在BIO-RAD循環(huán)反應(yīng)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取5μL PCR產(chǎn)物在1%TAE瓊脂糖凝膠電泳，用Good View Nucleic Acid Stain染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.5 cox1部分基因序列測定及其在種系發(fā)育分析中的應(yīng)用

將PCR產(chǎn)物送上海生工生物科技有限公司直接測序，測序結(jié)果用DNAStar 5.0軟件進(jìn)行分析。從GenBank檢索現(xiàn)有弓首蛔蟲cox1序列，然后與之進(jìn)行相似性比對和種系發(fā)育分析，以豬蛔蟲（Ascaris suum，NC_001327）作為外群，利用Mafft 7.122及Mega 5.0軟件對獲得的序列和Gen-Bank的弓首蛔蟲cox1部分序列進(jìn)行比對及計(jì)算遺傳距離，然后用PhyML 3.1程序中的最大似然法（Maximum likelihood，ML）繪制種系發(fā)育樹，采用MtArt+I+G模型進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

11個(gè)樣品均成功地?cái)U(kuò)增出約450 bp的片段，與預(yù)期pcox1目的片段長度相符，且無非特異性條帶，空白對照為陰性（圖1）。

圖1 犬弓首蛔蟲線粒體pcox1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析

2.2 測序結(jié)果及分析 11個(gè)樣品pcox1堿基序列長度相同，均為460bp，剔除引物和不準(zhǔn)確序列后，均得到394bp的序列。pcox1序列的A、G、T、C 堿基平均含量分別為41.5%、15.3%、28.4%和14.8%，A+T含量（69.9%）明顯高于G+C含量（30.1%）。對犬弓首蛔蟲11個(gè)不同個(gè)體的pcox1序列進(jìn)行種內(nèi)比較，結(jié)果顯示，pcox1基因序列變異堿基數(shù)總共為10個(gè)，變異率在0～2.5%之間，其中第1位密碼子變異2個(gè)，第2位密碼子變異3個(gè)，第3位密碼子變異5個(gè)。弓首蛔蟲pcox1基因序列的種間分析顯示，pcox1序列犬弓首蛔蟲種間存在比較大的差異，差異率在8.2%～11.6%之間。

2.3 犬弓首蛔蟲cox1基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

采用ML法建樹方法構(gòu)建弓首蛔蟲的系統(tǒng)發(fā)生樹（圖2），發(fā)現(xiàn)犬弓首蛔蟲廣東分離株具有高度同源性，位于同一大分枝，系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值較高。犬弓首蛔蟲廣東分離株所屬分枝與其他弓首蛔蟲所屬分枝相隔較遠(yuǎn)，得到了很好地鑒別。

圖2 基于pcox1基因序列以ML法所構(gòu)建的弓首蛔蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

在寄生蟲的傳統(tǒng)分類鑒定研究中常采用形態(tài)學(xué)鑒定方法，但這種方法有其局限性，比如難以區(qū)分由于自然、地理等生態(tài)環(huán)境因素引起的蟲株遺傳變化。將蟲種DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，再進(jìn)行序列分析是目前發(fā)展最快的一種分類鑒定寄生蟲的分子生物學(xué)方法。線粒體DNA由于其進(jìn)化速度快，母性遺傳，基因間不發(fā)生重組，可以反映出母系的進(jìn)化史等特點(diǎn)，非常適合作為分子標(biāo)記進(jìn)行種系發(fā)育研究。其中，cox1基因進(jìn)化速率較快，適合用于遺傳變異、分類和分子種系發(fā)生的研究。因此，在寄生蟲的分類鑒定和群體遺傳方面，許多學(xué)者研究認(rèn)為cox1基因序列是理想的遺傳標(biāo)記[15-18]。

本研究對湖南省益陽市4個(gè)地區(qū)的犬弓首蛔蟲的cox1基因序列進(jìn)行遺傳變異分析發(fā)現(xiàn)，種內(nèi)變異沒有區(qū)域性特點(diǎn)。研究結(jié)果顯示，犬弓首蛔蟲各湖南分離株之間cox1基因序列的相似性均在97%以上，湖南分離株與GenBank中其他蛔蟲相應(yīng)序列的相似度均低于92%。犬弓首蛔蟲種間的差異（8.2%～11.6%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于犬弓首蛔蟲種內(nèi)的變異（0～2.5%），說明pcox1能為種間的遺傳變異研究提供遺傳標(biāo)記，可用于犬弓首蛔蟲的種間鑒定檢測，符合先前的研究[8，14]。此外，本研究采用ML法構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示出犬弓首蛔蟲湖南分離株位于同一大分枝，系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值較高，犬弓首蛔蟲湖南分離株所屬分枝與其他弓首蛔蟲所屬分枝相隔較遠(yuǎn)，得到了很好的區(qū)別。本試驗(yàn)系首次研究了犬弓首蛔蟲湖南分離株的pcox1序列變異，發(fā)現(xiàn)犬弓首蛔蟲pcox1序列種內(nèi)變異較小，種間差異很大，是較理想的犬弓首蛔蟲種間鑒定檢測標(biāo)記。

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Analysis of Sequence Variation in Mitochondrial cox1 Gene of Toxocara canis Isolates in China

Liang Xuan，Liu Yi
（College of Veterinary Medicine，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128）

The objective of the study was to analyze sequence variation in the cytochrome c oxidase subunit 1（cox1）gene among Toxocara canis isolates from Hunan province and to study its phylogenetic relationship with other roundworms using the cox1 gene sequencing. The partial cox1（pcox1）were amplifi ed from individual T. canis samples，and pcox1 sequences were aligned using the Mafft 7.122. Maximum likelihood（ML）trees were constructed using the software PhyML 3.1. The lengths of all pcox1 sequences were 394bp. Sequence variations in pcox1 sequences within T. canis were 0～2.5% which was signifi cantly lower than inter-species differences（8.2%～11.6%）. Phylogenetic analyses showed that all T. canis isolates were clustered in the same clade. It was concluded that pcox1 sequence could be used as genetic marker for population genetic studies of T. canis，as well as genetic marker for the differentiation and identifi cation of different roundworms. The study provided foundation for further studies on molecular genetics and diagnosis of T. canis.

Toxocara canis；mitochondrial DNA；cox1 gene；phylogenetic relationship

S852.731

A

1005-944X（2015）03-0066-04

劉 毅