吳秀萍，王 迪，李庶東，孫召金，劉明遠

（1.中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，衛(wèi)生部寄生蟲與病原生物學(xué)重點實驗室，世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲和絲蟲病合作中心，上海 200025；2.吉林大學(xué)人獸共患病研究所，人獸共患病教育部重點實驗室，吉林長春 130062；3.中國96423部隊，陜西 721012）

消化法檢驗旋毛蟲病最適條件的篩選

吳秀萍1，2，王 迪2，李庶東3，孫召金2，劉明遠2

（1.中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，衛(wèi)生部寄生蟲與病原生物學(xué)重點實驗室，世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲和絲蟲病合作中心，上海 200025；2.吉林大學(xué)人獸共患病研究所，人獸共患病教育部重點實驗室，吉林長春 130062；3.中國96423部隊，陜西 721012）

[目的] 篩選出“消化法”檢測旋毛蟲病的最適檢測條件，即消化后收集蟲體所需要的沉降溫度和沉降時間，為改善現(xiàn)有屠宰動物旋毛蟲病“消化法”檢驗技術(shù)提供重要的參考數(shù)據(jù)。[方法] 將12個旋毛蟲國際標(biāo)準(zhǔn)蟲株（8個種和4個基因型）感染Balb/c小鼠，感染40天后剖殺，分別在4℃和25℃條件下計算不同時間點的回收肌幼蟲百分比，計算不同溫度不同時間點收集到的肌幼蟲數(shù)目與消化液原液總的肌幼蟲數(shù)目的比值及沉降速率。[結(jié)果] 比較發(fā)現(xiàn)旋毛蟲不同種及基因型在不同溫度和沉降時間上回收的肌幼蟲百分比存在明顯差異，確定出適合已知旋毛蟲每個種和基因型的消化法檢驗最適條件，篩選出最適條件為4℃沉淀、至少沉降45分鐘。[結(jié)論] 現(xiàn)有消化法檢驗旋毛蟲病的國際“金標(biāo)準(zhǔn)”確實存在一定的偏差和不足，在實際應(yīng)用中有可能造成旋毛蟲病的漏檢。本研究結(jié)果篩選出適合消化法檢驗旋毛蟲病的最適條件，為進一步完善消化法檢測旋毛蟲病的國際“金標(biāo)準(zhǔn)”提供參考。

旋毛蟲病；消化法；最適條件；篩選

旋毛蟲病是一種重要的食源性人獸共患寄生蟲病，呈世界性分布，目前在一些發(fā)展中國家（如泰國、 阿根廷及中國等）仍常有暴發(fā)，不但危害人類公共衛(wèi)生，而且成為影響豬肉生產(chǎn)和食品安全的重大經(jīng)濟問題之一。鑒于其暴發(fā)頻率、感染人數(shù)及危害性，在歐盟2006年公布15種重要新發(fā)與再發(fā)性人獸共患病病種中，旋毛蟲病作為唯一的食源性寄生蟲病名列其中，已成為世界各國更是世界衛(wèi)生組織（WHO）法規(guī)規(guī)定的屠宰動物強制性、首檢和必檢病種（我國始于1956年）[1-3]。

旋毛蟲國際消化法采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定[4]，但實際上旋毛蟲不同種與基因型存在不同的生物學(xué)特征[5，6]，因此理論上在消化和收集方法上應(yīng)存在一定的差異?！跋ā笔悄壳巴涝讋游镄x病檢驗的金標(biāo)準(zhǔn)方法，統(tǒng)一規(guī)定在室溫（25℃左右）沉降30分鐘。但某些種或基因型可能會因沉降溫度不適、沉降時間不足導(dǎo)致無法全部回收消化后的所有幼蟲，這不但可導(dǎo)致旋毛蟲感染程度的誤判，更為嚴(yán)重的是可能導(dǎo)致旋毛蟲病的漏檢（幼蟲沒有沉下來，誤判為陰性）。

本研究以Balb/c小鼠為動物模型，利用實驗室保存?zhèn)鞔男x12個國際標(biāo)準(zhǔn)株（8個種和4個基因型）感染Balb/c小鼠，按照旋毛蟲國際標(biāo)準(zhǔn)集樣消化法，分別在4℃和25℃條件下，計算不同時間點的肌幼蟲的回收率及沉降速率，針對已知的旋毛蟲8個種和4個基因型，通過系統(tǒng)比較和分析消化法檢測條件上的差異，篩選出適合消化法檢驗旋毛蟲的最佳條件，以期改善現(xiàn)有旋毛蟲國際標(biāo)準(zhǔn)消化方法可能存在的弊端。因此，本研究項目的開展對進一步完善屠宰動物旋毛蟲病檢驗“金標(biāo)準(zhǔn)”具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。

1 材料

1.1 實驗動物

傳代小鼠用昆明小鼠，購自白求恩醫(yī)學(xué)院；計數(shù)小鼠購自白求恩醫(yī)學(xué)院的6～8周齡的Balb/c小鼠。

1.2 旋毛蟲蟲株

旋毛蟲12個國際標(biāo)準(zhǔn)株 ：本實驗室保存?zhèn)鞔?，分別是：T1（ISS004）、T2（ISS042）、T3（ISS100）、T4（ISS013）、T5（ISS415）、T6（ISS034）、T7（ISS037）、T8（ISS124）、T9（ISS408）、T10（ISS572）、T11（ISS1029）、T12（暫未明確）

1.3 主要試劑和儀器

胃蛋白酶（1∶10000）和胃蛋白酶（1∶3000）購自 AMRESCO公司；濃鹽酸、醫(yī)用低溫冰箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高速自控組織搗碎機、恒溫磁力攪拌器和顯微鏡。

2 方法

2.1 感染性實驗

取實驗室保種傳代的昆明小鼠剖殺，通過消化法分別收集12個標(biāo)準(zhǔn)蟲株的肌幼蟲，按照300條/只的劑量接種Balb/c小鼠，每個旋毛蟲蟲株接種15只，接種后每天觀察其狀況。

2.2 沉降溫度和沉降時間對各蟲株肌幼蟲回收率的影響

旋毛蟲國際消化法：小鼠剝皮去內(nèi)臟，用絞肉機絞碎，集樣稱取100g鼠肉消化。用燒杯裝2L的46℃胃蛋白酶消化液，將絞碎的鼠肉倒進消化液里，在46℃溫箱內(nèi)攪拌消化30min，將消化液通過80目篩網(wǎng)過濾到2L的分液漏斗內(nèi)，沉降半小時，用小燒杯收集40mL的沉降液在顯微鏡下觀察計數(shù)。

本實驗對感染40天的小鼠，每個蟲株取15只，分成三組剖殺（即重復(fù)三次），先按照標(biāo)準(zhǔn)消化法進行消化并抽取消化原液計數(shù)，計算出每一個蟲株所收集到的肌幼蟲總數(shù)；重懸混勻蟲體，進一步通過改變沉降溫度和沉降時間，檢測其肌幼蟲回收率，具體方法如下：

2.2.1 抽取消化原液計數(shù)。首先在消化完全后，在消化液混勻的狀態(tài)下，抽取10mL消化液，分裝在24孔板上，每一毫升要分為4個孔。因為每個孔在低于250uL液體的時候才能看清楚。在顯微鏡下計數(shù)，得出每毫升消化液里的肌幼蟲數(shù)目。然后用計算得到的每毫升肌幼蟲數(shù)目×消化液體積=肌幼蟲總數(shù)。

2.2.2 沉降溫度和時間。沉降溫度分為4℃和25℃；沉降時間分為20min、30min、45min、

60min、75min 5個時間點，每個時間點取40mL沉降液體，計數(shù)。

2.2.3 計算沉降速率和統(tǒng)計沉降最適條件。在各個溫度的時間點上計算沉降肌幼蟲占肌幼蟲總數(shù)的百分比，確定旋毛蟲不同種及基因型的最佳沉降溫度時間條件。用分液漏斗裝入2L消化液后的液體高度，除以沉降肌幼蟲百分比達100%時的時間，得到沉降速率。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)本實驗數(shù)據(jù)，按照標(biāo)準(zhǔn)的旋毛蟲國際消化法統(tǒng)計出在室溫條件下沉降30min，旋毛蟲不同種和基因型回收率情況；回收率達到99%以上所需要的沉降條件；不同種和基因型在不同沉降溫度和沉降時間回收率到達99%以上的平均沉降速率；通過消化法收集肌幼蟲回收率達到95%以上所需要的沉降條件。

3 結(jié)果

3.1 不同溫度和沉降時間對肌幼蟲回收率的影響

回收率是指在集樣消化法中不同沉降時間收集到的肌幼蟲數(shù)目與利用原消化液計算的總肌幼蟲數(shù)目的百分比。旋毛蟲8個種和4個基因型在4℃和25℃條件下，不同時間點即20min，30min，45min，60min，75min回收率明顯不同，在25℃大多數(shù)回收率都低于99%，只有T11達到99%以上，本實驗12個旋毛蟲蟲株的回收率情況如下：

（1）T1、T3、T4、T11的肌幼蟲回收率受溫度影響不大：T1在4℃或者25℃下沉降60分鐘，回收率達99%以上；T3沉降時間從45分鐘至75分鐘，回收率基本維持在93%～94%之間；T4在4℃和 25℃沉降45-75分鐘，回收率均維持在95-98%之間；T11在4℃和25℃沉降30分鐘，回收率均可達99%以上；

（2）T2、T5、T6、T7、 T8、T9、T12均在4℃沉降回收為佳：T2沉降時間延長至75分鐘回收率也僅為97.08%；T5延長沉降時間至75分鐘，回收率達到99.41%；T6沉降時間在45分鐘，回收率可達99%以上；T7在 4℃比25℃回收率偏高，在4℃沉降45分鐘，回收率可達99.54%，在25℃延長至75分鐘回收率為98.39%；T8沉降時間為30分鐘，回收率可達99.57%；T9肌幼蟲回收率在4℃比25℃偏高，在4℃沉降60分鐘，回收率可達99.17%，而在25℃需要75分鐘；T12沉降時間延伸到75分鐘以上，回收率仍低于90%。

（3）T10肌幼蟲回收率在25℃回收率稍有偏高，但沉降時間延長至75分鐘回收率仍低于99%；

3.2 按照國際消化法室溫沉降30min能收集到的T1-T12的肌幼蟲數(shù)目百分比

根據(jù)本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計，按照標(biāo)準(zhǔn)的旋毛蟲國際消化法，在室溫條件下沉降30min，不同種回收率有明顯差異，并且只有T11的回收率可達到99%以上，甚至T10和T12的回收率還達不到80%，詳見表1。

表1 國際消化法回收到的肌幼蟲百分比

3.3 本實驗中T1-T12消化法收集肌幼蟲回收率達到99%以上的沉降條件

根據(jù)本實驗數(shù)據(jù)，統(tǒng)計出旋毛蟲8個種和4個基因型通過消化法收集肌幼蟲回收率達到99%以上所需要的沉降條件明顯不同，僅有T8和T11在沉降時間為30分鐘時回收率達到99%以上，其它都需要延長沉降時間且多在4℃沉降為佳，對于T2、T3、T4、T10和T12沉降時間延長至75分鐘回收率也無法達到99%以上，詳見表2。

3.4 T1-T12沉降速率

沉降速率：分液漏斗高度與T1-T12回收率達到99%以上所需時間的比值。在本實驗中，進一步系統(tǒng)地計算出旋毛蟲8個種和4個基因型在不同沉降溫度和沉降時間回收率到達99%以上的平均

沉降速率（除了T2、T3、T4和T12），結(jié)果表明T11沉降最快，T5和 T10較慢，其他幾個種和基因型沉降速率沒有太大差異，詳見表3。

表2 T1-T12肌幼蟲回收率到達99%以上所需沉降條件

表3 T1-T12沉降速率表

3.5 T1-T12回收率達到95%以上時的溫度和時間條件

在屠宰場檢驗時，要求時效性，以節(jié)省時間和以實際應(yīng)用為目的，故統(tǒng)計出在沉降百分比達到95%以上的最適沉降溫度和時間。結(jié)果表明：除了T3、T10和T12，其他種和基因型均在低于45min回收率可達到95%以上，其中T3和T11僅需要20min，沉降溫度多在4℃為佳，詳見表4。

4 討論

旋毛蟲的檢測方法主要包括：鏡檢法、集樣消化法和血清學(xué)檢測[4]。鏡檢法和集樣消化法屬于直接檢測法，目前旋毛蟲檢驗“金標(biāo)準(zhǔn)”是集樣消化法。對于常規(guī)屠宰豬尸體檢驗，用消化法消化至少1g最佳部位的肉來檢查；為達到更高的診斷敏感性，對于馬肉和野味肉，應(yīng)選取至少5-10g的最佳部位肌肉分別進行消化；人工消化法允許檢測100克尸體碎塊。盡管人工消化法需要更多的技術(shù)設(shè)備，但它滿足了成本效益和敏感性、效率的要求，沒有包囊的旋毛蟲在液態(tài)消化液里也可以被檢測出來。通過消化液（含有1%胃蛋白酶和1%濃鹽酸）使肌幼蟲釋放出來，經(jīng)過濾和沉降過程，在顯微鏡下檢測肌幼蟲[4]，目前旋毛蟲檢驗國際“金標(biāo)準(zhǔn)”的集樣消化法采用統(tǒng)一的沉降條件，即消化后在室溫（25℃左右）沉降30分鐘，鏡檢肌幼蟲。

表4 T1-T12肌幼蟲回收率到達95%以上所需沉降條件

根據(jù)旋毛蟲國際消化法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，本研究結(jié)果表明已知12個旋毛蟲蟲種的肌幼蟲回收率均未能達到100%，只有T8和T11的肌幼蟲回收率可以達到99%以上且沉降速率較快，其他在75%～98%之間，且多數(shù)在4℃沉降為佳，因此本研究證實了旋毛蟲國際消化法的金標(biāo)準(zhǔn)的確存在一定的偏差和不足，表明現(xiàn)有旋毛蟲消化法的國際“金標(biāo)準(zhǔn)”在實際應(yīng)用中有可能造成旋毛蟲病的漏檢。另外，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)沉降溫度對T2的肌幼蟲回收率影響很大，在低溫環(huán)境下沉降速度較快，這可能與其地理分布有關(guān)，T2主要分布在低溫地區(qū)，是最耐冷的旋毛蟲蟲種，在冰凍的肌肉中甚至能存活幾年；而T10肌幼蟲整體上沉降速度都很慢，這可能與其形態(tài)有關(guān)，T10是無包囊旋毛蟲，在肌肉中呈伸展長條狀，消化后肌幼蟲劇烈運動及不卷曲形態(tài)影響了其沉降速度；T5多數(shù)成松散卷曲或曲線、運動緩慢、在液體中懸浮，這些形態(tài)特征極大地影響了其沉降速度；T12的肌幼蟲體型最細(xì)小，多數(shù)都成漂浮狀態(tài)，也許因其比重較低導(dǎo)致其沉降很慢、肌幼蟲回收率很低，即使沉降時間延長到75分鐘，也僅僅達到89%左右的回收率。因此，旋毛蟲不同種及基因型的生物學(xué)特性的差異[5-9]，如地理分布、耐冷耐熱、形態(tài)大小、運動形態(tài)、有無包囊、宿主及繁殖能力等可能與肌幼蟲回收率的高低密切相關(guān)。

本研究成功篩選出適合消化法檢驗旋毛蟲病的最適條件，為進一步完善現(xiàn)有旋毛蟲病檢驗“金標(biāo)準(zhǔn)”（即“集樣消化法”）的提供了重要實驗參考數(shù)據(jù)，對規(guī)范旋毛蟲病診斷方法具有重要意義。

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The Screening of Optimum Conditions of Digestion Method for Detecting Trichinellosis

Wu Xiuping1，2，Wang Di2，Li Shudong3，Sun Zhaojin2，Liu Mingyuan2
（1.National Institute of Parasitic Diseases，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Laboratory of Parasite and Vector Biology，Ministry of Health，WHO Collaborating Centre for Malaria，Schistosomiasis and Filariasis，Shanghai 200025；2.Institute of Zoonoses，Key Laboratory of Zoonoses，Ministry of Education，Jinlin University，Changchun，Jilin 130062；3.PLA Unit 96423，Shaanxi 721012）

[Objective] To screen the optimum conditions including sedimentation temperature and sedimentation coefficient in collecting larvae after digestion，providing important reference data to improve the current “digestion method” for detecting trichinellosis in slaughtering animals.[Methods] 12 international reference Trichinella strains including 8 species and 4 genotypes were used experimentally to infect Balb/c mice，which were killed 40 dpi. The ratio of recovered muscle larvae and total muscle larvae in the digesting fluid were calculated respectively at 4 ℃ and 25 ℃and at different time points，and then the sedimentation coefficient of different Trichinella species and genotypes were compared and analyzed. [Results] It was found through comparison that the muscle larvae recovery rates differed significantly in different Trichinella species and genotypes at different sedimentation temperature and time. The optimum conditions of digestion method for the known Trichinella species and genotypes were screened：the digested larvae should be settled at 4℃ for at least 45min. [Conclusion] This study demonstrated the current international gold method for detection of Trichinellosis by means of digestion had certain bias resulting in misdetection. The screening optimum conditions of digestion method for detecting different Trichinella species and genotypes in the study provided the reliable experimental data and reference value to improve international gold digestion method for detecting Trichinella.

Trichinellosis；Digestion Method；Optimum Conditions；Screening

R383.15

B

1005-944X（2015）03-0062-05

國家自然科學(xué)基金資助項目（NSFC31030064）

吳秀萍，劉明遠