羅玉江，李 靜，蘇貴成，屈勇剛，曹樹珠，李 巖

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊 830063）

奶牛場主要病毒性繁殖障礙疫病感染情況調(diào)查

羅玉江1，李 靜2，蘇貴成2，屈勇剛，曹樹珠1，李 巖2

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，新疆烏魯木齊 830063）

［目的］調(diào)查4個(gè)奶牛場主要病毒性繁殖障礙疫病的感染情況，為進(jìn)一步進(jìn)行病原學(xué)研究，揭示其致病作用，以及為制定防治措施奠定基礎(chǔ)。［方法］選取4個(gè)規(guī)?；膛?，采集死胎、流產(chǎn)胎兒的肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)等組織，伴有肺炎癥狀犢牛的鼻拭子和耳組織，腹瀉犢牛糞便，初乳以及凍精樣品，共計(jì)248份。采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR/PCR檢測方法，對牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（BVDV）、牛副流感病毒3型（BPIV-3）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）進(jìn)行檢測。［結(jié)果］發(fā)現(xiàn)BVDV、BPIV-3、IBRV的總陽性率分別為11.29%（28/248）、10.00%（18/180）、9.26%（15/162）。［結(jié)論］這4個(gè)奶牛場存在BVDV、BPIV-3、IBRV的感染，調(diào)查結(jié)果為規(guī)?；膛龇敝痴系K類主要病毒性疫病的防控提供了流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

BVDV；BPIV-3；IBRV；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR/PCR

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，生活條件改善，人類對奶制品需求量不斷增加，加之國家對農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的不斷深入，我國奶牛規(guī)?；B(yǎng)殖得到快速發(fā)展。目前，我國奶牛存欄量和奶產(chǎn)量均已位居世界第三。但同畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國家相比，我國奶業(yè)發(fā)展基礎(chǔ)依然薄弱，奶牛疫病防控方面仍面臨諸多問題亟待解決[1]。新疆土地面積遼闊、草場資源豐富，畜牧業(yè)在國內(nèi)長期占有重要地位。近年來，新疆部分地區(qū)發(fā)生奶牛繁殖障礙類疫病日趨嚴(yán)重，在

很大程度上制約了新疆奶產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。2011年，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站對新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一、第七、第八師規(guī)模化奶牛場開展調(diào)查，結(jié)果顯示奶牛繁殖障礙類傳染病的感染率達(dá)到11.2%。因此，本研究選取4個(gè)規(guī)模化奶牛場，對牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus 3，BPIV-3）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光RT-PCR/PCR檢測分析，以期為相關(guān)疫病的防控提供流行病學(xué)數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 樣品的來源

樣品來源為新疆北部4個(gè)規(guī)模化奶牛場，主要飼養(yǎng)品種為中國荷斯坦奶牛，存欄量在2000頭以上，牛場位于農(nóng)牧區(qū)，周圍無其它養(yǎng)殖場。于2014年3月至2014年12月，采集流產(chǎn)死胎的肝、脾、肺、腎臟及淋巴結(jié)等組織59頭份；1～2月齡患有肺炎的犢牛的鼻拭子81頭份及耳組織31頭份；2月齡內(nèi)腹瀉犢牛的糞便37頭份；流產(chǎn)死胎母牛所產(chǎn)的初乳18頭份；總共226頭份。22份凍精由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站提供，樣品采集來源情況如表1所示。

表1 4個(gè)規(guī)?；膛鰳悠凡杉闆r統(tǒng)計(jì)表

1.2 主要試劑

牛病毒性腹瀉（BVD）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒（批號：BVD20140926P）、牛副流感病毒3型（BPIV-3）實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒（批號：BPI20140926P）、牛皰疹病毒1型（BHV-1）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒（批號：BH20140926P）均購于北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

LightCycler? 480 Ⅱ熒光PCR儀，PikoReal TCR0024/TCR0096 熒光PCR儀。

1.4 檢測方法

BVDV、BPIV-3、IBRV的檢測均參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR/PCR檢測方法，從59份流產(chǎn)死胎和81份患有肺炎的犢牛的鼻拭子中，檢出BVDV、BPIV-3和IBRV；而在31份患有肺炎的犢牛耳組織和37份腹瀉的糞便樣品中，對BVDV進(jìn)行了檢測，未檢出有該病毒；從母牛流產(chǎn)死胎與配公牛的凍精中，未檢出病毒；從流產(chǎn)死胎母牛的初乳中，未檢測到BVDV和BPIV-3。在所檢測的組織病料樣品中，BVDV、BPIV-3和IBRV的總陽性率分別為11.29%（28/248）、10.00%（18/180）、9.26%（15/162）。

其中，對每頭流產(chǎn)死胎犢牛的組織進(jìn)行混樣檢測，59份流產(chǎn)死胎中BVDV、BPIV-3、IBRV的陽性率分別為25.42%（15/59）、25.42%（15/59）、5.08%（3/59）；81份患有肺炎的犢牛的鼻拭子中BVDV、BPIV-3、IBRV陽性率分別為16.05%（13/81）、3.70%（3/81）、14.81%（12/81），詳見表2。

表2 4個(gè)規(guī)模化奶牛場三種病毒檢測結(jié)果

在同一份樣品中，同時(shí)檢測到2～3種病毒的情況。在流產(chǎn)死胎中同時(shí)檢測到BVDV、BPIV-3和IBRV三種病毒的占3.39%（2/59）；在鼻拭子中，BVDV與BPIV-3同時(shí)檢測到的占2.47%（2/81），而BVDV與IBRV同時(shí)檢測到的也占2.47%（2/81）。

3 討論

據(jù)報(bào)道，BVDV和IBRV均可通過子宮感染，引起孕畜流產(chǎn)和產(chǎn)死胎、弱胎、不育等癥狀，是造成奶牛繁殖障礙的重要病毒性病原。其中，BVDV已被證明是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致牛病尤其是繁殖性疾病的最主要的病毒之一，同時(shí)，BVDV還可引起免疫抑制和持續(xù)性感染，繼而導(dǎo)致其他病原體對機(jī)體的致病性增強(qiáng)[2]。IBRV主要引起牛嚴(yán)重的上呼吸道疾病及氣管黏膜發(fā)炎、呼吸困難、流鼻液等，還可引起懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及生殖道感染、結(jié)膜炎、乳腺炎等多種病癥［3-5］。BPIV-3是引起牛急性呼吸道疾病的主要病毒之一，也可通過子宮感染，引起孕畜流產(chǎn)[5]。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR/PCR檢測方法，對4個(gè)規(guī)模化奶牛場進(jìn)行BVDV、BPIV-3、IBRV感染情況調(diào)查，證實(shí)存在感染。同時(shí)，對59份流產(chǎn)死胎組織檢測，BVDV、BPIV-3、IBRV在流產(chǎn)死胎中具有較高的感染率，還存在BVDV、BPIV-3和IBRV三種病毒在同一份組織混樣中同時(shí)檢測到的情況，提示該3種病毒在致奶牛繁殖障礙中存在混合感染或繼發(fā)感染的可能，為后期制定相應(yīng)防控措施提供了依據(jù)。

在1～2月齡發(fā)病犢牛的鼻拭子中，BVDV和IBRV的檢出率較高，也存在兩種病毒在同一份樣品中同時(shí)檢測到的情況。若BVDV感染孕期胎兒，出生犢牛則可能成為持續(xù)性感染者，處于免疫耐受狀態(tài)，持久帶毒排毒。而對于持續(xù)性感染的犢牛，耳組織檢測具有很高的敏感性和特異性，但從發(fā)病犢牛的耳組織中未檢測到BVDV，說明犢牛發(fā)病可能是通過外界感染BVDV或別的致病菌造成的。因此，及時(shí)對發(fā)病動(dòng)物進(jìn)行隔離治療或淘汰，避免相互感染傳播，同時(shí)搞好環(huán)境衛(wèi)生及消毒工作，可減少有害致病菌的滋生。對感染率較高的牛場和在高發(fā)季節(jié)，可通過疫苗預(yù)防，降低發(fā)病率；加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保證飼料營養(yǎng)全價(jià)，增強(qiáng)牛的體質(zhì)；消除不利條件，如冬季注意保暖，夏季注意避暑等。

對流產(chǎn)死胎的組織檢測發(fā)現(xiàn)BVDV和BPIV-3的感染率較高，因此，對其母牛所分泌的初乳進(jìn)行這兩種病毒的檢測，但未檢測到這兩種病毒。BVDV可引起牛的嚴(yán)重腹瀉，青年牛最易發(fā)生，而3月齡內(nèi)犢?？赡苁苣冈纯贵w的保護(hù)，由BVDV引起的腹瀉很少發(fā)生，因此從2月齡內(nèi)腹瀉犢牛的糞便中未檢測出該病毒。

BVDV、BPIV-3、IBRV均可通過子宮感染，引起母牛的繁殖障礙。因此提高繁殖技術(shù)，控制傳染性因素，如對引起繁殖障礙頻率較高的與配公牛的精液進(jìn)行檢測，淘汰被污染的凍精，可減少母牛繁殖障礙的發(fā)生。

4 結(jié)論

4.1 通過實(shí)時(shí)熒光探針PCR/RT-PCR檢測，從流產(chǎn)死胎組織中檢測出BVDV、BPIV-3、IBRV，且檢出率較高，存在幾種病毒在同一樣品中同時(shí)檢測到的情況，揭示這些病毒在致奶牛繁殖障礙中起著重要的作用，存在有混合感染或繼發(fā)感染的可能，但其致病性有待于進(jìn)一步研究。

4.2 IBRV和BPIV-3也是引發(fā)呼吸道疾病的重要病毒，在發(fā)病牛中檢出率較高，呈現(xiàn)出混合感染的趨勢。因此，及時(shí)對發(fā)病動(dòng)物進(jìn)行隔離治療或淘汰，避免相互感染傳播，同時(shí)搞好環(huán)境衛(wèi)生及消毒工作，可有效減少有害致病菌的滋生，防止繼發(fā)感染。在感染率較高牛場和高發(fā)季節(jié)，可提前采取一些相應(yīng)的預(yù)防措施，做好防疫性的工作。

4.3 通過對組織病料進(jìn)行病原學(xué)檢測，初步確定了致奶牛繁殖障礙的主要病毒性病原種類及感染情況，為進(jìn)一步進(jìn)行病原學(xué)的研究，揭示其致病作用，以及為制定防治措施奠定了基礎(chǔ)。

[1] 王洪梅，侯佩莉，宋玲玲，等. 國內(nèi)外奶牛主要病毒病的流行現(xiàn)狀及防控技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國畜牧雜志，2014，50（10）：42-49.

[2] 安德魯斯AH.牛病學(xué)-疾病與管理[M].韓博，譯.2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2006：230-244.

[3] 王海燕，朱遠(yuǎn)茂，薛飛，等.牛傳染性鼻氣管炎病毒gE基因的截短克隆與表達(dá)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（3）：289-293.

[4] 顏邦芬.牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體間接ELISA 的建立及其在流行病學(xué)研究中的應(yīng)用[D] .華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007：5-7.

[5] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：299-300.

An Investigation of Main Viral Disease Infections Causing Reproductive Failure in 4 Dairy Farms

Luo Yujiang1，Li Jing2，Su Guicheng2，Qu Yonggang1，Cao Shuzhu1，Li Yan2
（1. College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832000；2.The General Station of Animal Husbandry and Veterinary Medicine of Xinjiang Production and Construction Corps，Urumqi，Xinjiang 830063）

[Objective] To investigate main viral disease infection causing reproductive failure in 4 dairy farms，reveal its pathogenic role by further etiology study，and lay a foundation for the development of prevention and control measures.[Method] 248 samples，including tissues of lung，liver，spleen，kidney，lymph nodes，etc from miscarriages or stillbirth，nasal swab and ear tissue from calves with pneumonia ，stool from calves with diarrhea，colostrum and frozen semen were collected from four scale dairy farms for detection of bovine viral diarrhea virus（BVDV），bovine parainfluenza virus 3（BPIV-3）and infectious bovine rhinotracheitis virus（IBRV）by real-time fluorescence RT-PCR / PCR . [Result] The results showed that the infection rate of BVDV，BPIV-3 and IBRV were 11.29%（28/248），10.00%（18/180）and 9.26%（15/162），respectively.[Conclusion] The survey indicated that it was existence of the three viral infection in 4 dairy farms.The results would provide epidemiological data for the diseases prevention and control in scale dairy farms.

BVDV；BPIV-3；IBRV；real-time RT-PCR / PCR

S858.23

B

1005-944X（2015）06-0015-03

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2013BA004）

李 巖，屈勇剛