田國寧，張金玲，李 凱，田國華，丁葵英

（濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041）

水貂阿留申病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）檢測方法的建立

田國寧，張金玲，李 凱，田國華，丁葵英

（濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041）

為建立一種簡便、快速、特異的水貂阿留申病毒（ADV）檢測方法，根據(jù)GenBank中已登錄的ADV基因組序列，選擇水貂阿留申病毒VP2基因作為靶基因，設(shè)計并合成5套環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）反應(yīng)所需的引物，通過試驗(yàn)篩選出最佳引物，并進(jìn)行最佳引物的特異性及敏感性試驗(yàn)，建立了LAMP快速檢測方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法比普通PCR方法靈敏性高10倍，與其他的水貂源病毒不發(fā)生非特異性反應(yīng)，并且具有良好的重復(fù)性。利用建立的LAMP檢測方法對30份臨床樣品的陽性檢出率為6.7%。該方法簡便快速，為水貂阿留申病的檢測提供了新的發(fā)展方向，有望成為簡易的常規(guī)檢測手段，尤其適用于基層應(yīng)用。

水貂；阿留申病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）；檢測；VP2基因

水貂阿留申病（Aleutian disease of mink，AD）又稱漿細(xì)胞增多癥（Plasmacytosis）[1]。是由水貂阿留申病病毒（Aleutian mink disease virus，ADV）侵害水貂引起的一種慢性進(jìn)行性傳染病，以水貂繁殖能力下降、貂體消瘦、自身免疫病、高免疫球蛋白血癥、對細(xì)菌的易感性增加、腎衰竭死亡為基本特點(diǎn)[2]，一直是危害世界養(yǎng)貂業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。該病幾乎存在于所有養(yǎng)貂的國家和地區(qū)，呈世界性分布的特點(diǎn)[1]。

目前，實(shí)驗(yàn)室檢測ADV的方法主要有病毒分離[1]、血清學(xué)診斷[3]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）[4]、熒光定量PCR[5]、基因檢測芯片[6]等，這些方法耗時較長，操作較為復(fù)雜，且需要特殊的儀器設(shè)備。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)是由日本學(xué)者Notomi等[7]開發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，在恒溫條件下利用一種鏈置換DNA聚合酶，幾十分鐘即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，具有快速、簡便等特點(diǎn)，有著廣泛的應(yīng)用前景[7-9]。本研究參考GenBank中已發(fā)表的ADV基因組序列，選擇水貂阿留申病毒

VP2基因作為靶基因，根據(jù)LAMP 引物設(shè)計軟件，設(shè)計并合成5套LAMP反應(yīng)所需的引物，通過試驗(yàn)篩選出最佳引物，并進(jìn)行最佳引物的特異性及敏感性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品

水貂阿留申病毒、犬瘟熱病毒、細(xì)小病毒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所提供；人基因組、鼠基因組由北京藍(lán)譜生物科技有限公司提供。

陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備：根據(jù)水貂阿留申病毒VP2基因序列，由大連寶生物公司純?nèi)斯ず铣少|(zhì)粒，基因全長528bp。

1.2 儀器

實(shí)時濁度儀：日本榮研LA-320c；核酸蛋白分析儀：Beckman DU800；PCR儀 ATC401，凝膠成像儀：法國VILBER 3026。

1.3 試劑

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法FDR熒光檢測試劑盒：北京藍(lán)譜生物科技有限公司；病毒DNA提取純化 試 劑 盒：Promega；2xTaq PCR Master mix：TIANGEN；引物合成：大連寶生物工程有限公司。

1.4 方法

1.4.1 DNA 模板的制備。利用病毒DNA提取純化試劑盒說明書進(jìn)行制備。

1.4.2 LAMP 反應(yīng)引物的設(shè)計。選擇水貂阿留申病毒VP2基因作為靶基因，根據(jù)LAMP引物設(shè)計軟件網(wǎng)址：http：//primerexplorer.jp/e/，將待擴(kuò)增的DNA 分為六個獨(dú)立的區(qū)域，根據(jù)這六個區(qū)域分別設(shè)計LAMP 反應(yīng)所需的引物（內(nèi)引物FIP 和BIP、外引物F3 和B3、環(huán)引物L(fēng)B、LF），共設(shè)計5套LAMP引物擴(kuò)增VP2基因。

1.4.3 LAMP 反應(yīng)。根據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法FDR熒光檢測試劑盒配制26μL 反應(yīng)混合物，將混合物置于65℃恒溫反應(yīng)60min。以雙蒸水為陰性對照。

1.4.4 LAMP 反應(yīng)結(jié)果檢測

1.4.4.1 濁度法檢測 采用實(shí)時濁度儀檢測，每隔6秒測定反應(yīng)管的濁度并繪制成曲線來判斷反應(yīng)的陰陽性。

1.4.4.2 顯色法檢測 基于鈣黃綠素顏色改變檢測，陰性時為橙色，陽性時為綠色。

1.4.5 LAMP 方法敏感性實(shí)驗(yàn)。為驗(yàn)證LAMP方法的檢測靈敏度，以含VP2片段的質(zhì)粒為檢測對象，定量后將總DNA按10倍稀釋度稀釋，使得最終拷貝數(shù)為105拷貝/μL、104拷貝/μL、103拷貝/μL、102拷貝/μL、101拷貝/μL、100拷貝/μL，并以雙蒸水作為陰性對照。然后進(jìn)行LAMP反應(yīng)，分別采用濁度法和顯色法來檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳引物的篩選

以本研究設(shè)計的5套引物對含VP2片段的質(zhì)粒（質(zhì)粒濃度108拷貝/μL）進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，最先發(fā)生LAMP反應(yīng)的引物組合為最佳引物，從圖1中看出ADV21、ADV8、ADV55、ADV46、ADV37引物組開始發(fā)生LAMP反應(yīng)的時間是分別是第16min、22min、24min、29min、40min，故將ADV21引物組選為最佳引物。

ADV21引物組：

ADV21-F3：GATAGACAATGTAACCATAAAGACT

ADV21-B3：TTGGTTTGGTTGCTCTCC

ADV21-FIP：CGACGCAGTTAAGTCATTGTTGATTTT GTAACAGAAACCAACCAAGGTA

ADV21-BIP：TACAGGTTGCTTTAGACACTAACAAT TTTAAGGAACAAAGCCCAGTG

ADV21-LB：CATATACTCCAGCTGCGCCGTT

圖1 最佳引物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 最佳引物的特異性實(shí)驗(yàn)

陰性對照以水作為模板，陽性對照用含VP2

的質(zhì)粒作為模板，并用人基因組、鼠基因組、細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒作為對照以檢測特異性。當(dāng)反應(yīng)體系中存在VP2基因時，便發(fā)生LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量的白色沉淀，反應(yīng)液的濁度表現(xiàn)為曲線上升，從圖2中可以看出只有陽性對照的曲線發(fā)生了上升，其他曲線均沒有變化，表明設(shè)計的引物具有良好的特異性。采用鈣黃綠素染色來觀察結(jié)果，與濁度法一致（圖3）。

圖2 最佳引物的特異性濁度法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 最佳引物的特異性染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 最佳引物的敏感性試驗(yàn)與PCR方法的比較及LAMP最佳反應(yīng)時間的確定

2.3.1 最佳引物的敏感性試驗(yàn)與PCR方法的比較。將10倍梯度稀釋的含VP2基因的質(zhì)粒模板（105拷貝/μL、104拷貝/μL、103拷貝/μL、102拷貝/ μL、101拷貝/μL、100拷貝/μL）用于LAMP 反應(yīng)和PCR反應(yīng)。LAMP 反應(yīng)檢測結(jié)果見圖4，顯色法與濁度法實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，LAMP最低檢測濃度為101拷貝/μL（見圖5）。PCR反應(yīng)引物為ADV21-F3，ADV21-B3，凝膠電泳檢測結(jié)果見圖6?？梢钥闯觯琍CR最低檢測濃度為102拷貝/μL。

圖4 最佳引物檢測的敏感性濁度法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 最佳引物檢測的敏感性染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 PCR敏感性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 LAMP最佳反應(yīng)時間的確定。LAMP反應(yīng)時間定為能檢測到質(zhì)粒103拷貝/μL的時間為最佳，但是不能過分追求其敏感性以防止假陽性的出現(xiàn)，故結(jié)合本實(shí)驗(yàn)最佳引物的敏感性，將LAMP反應(yīng)時間定為50分鐘。

3 采集水貂樣品用LAMP方法檢測ADV

到本轄區(qū)水貂養(yǎng)殖場采集水貂病料（糞便、尿液、血清、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)），共采集樣本30份。經(jīng)LAMP濁度法和顯色法檢測，30份樣本中檢出了2份陽性樣本，試驗(yàn)結(jié)果見圖7、圖8。從圖中可以看出，樣品8號和19號為陽性樣本。

圖7 濁度法檢測結(jié)果

圖8 顯色法檢測結(jié)果

4 討論與結(jié)論

本研究探索建立了水貂阿留申病毒VP2基因LAMP的診斷方法。經(jīng)驗(yàn)證，本方法具有良好的穩(wěn)定性，從結(jié)果中可以看到，與常規(guī)PCR方法比較，當(dāng)樣品模板稀釋至10拷貝/μL時PCR反應(yīng)已經(jīng)很難得到明確的結(jié)果，而LAMP反應(yīng)結(jié)果稀釋到10拷貝/μL依然能夠清晰地通過肉眼判斷（圖5），由此可見LAMP具有較高的靈敏度。通過肉眼判斷LAMP結(jié)果十分困難，要求更精確的結(jié)果可用濁度儀進(jìn)行檢測，而采用顯色法，我們可輕松準(zhǔn)確地判讀至10拷貝/μL稀釋樣品，檢測過程無須額外設(shè)備，同時也省去了常規(guī)PCR方法需要電泳分析的操作，大大降低了技術(shù)的使用成本，易于普及推廣。

綜上所述，本研究建立的水貂阿留申病LAMP檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、成本低等特點(diǎn)，為水貂阿留申病的檢測提供了新的發(fā)展方向，有望成為簡易的常規(guī)檢測手段，尤其適合在基層推廣、應(yīng)用。通過進(jìn)一步的優(yōu)化和完善，該技術(shù)方法可在ADV的診斷及防控方面發(fā)揮作用，為水貂阿留申病的診斷與防控提供技術(shù)支持。

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Development of Loop-Mediated Isothermal Amplifi cation（LAMP）Assay for Detection of Aleutian Disease Virus（ADV）

Tian Guoning，Zhang Jinling，Li Kai，Tian Guohua，Ding Kuiying
（Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang，Shandong，261041）

The aim of the study was to develop a simple，rapid and specific assay for ADV detection. Based on the genomic sequence data of ADV in GenBank，five primers were designed and synthesized with VP2 as target gene. By comparing specificity and sensitivity of the primers，a LAMP assay was developed，which was proved to be 10 times more sensitive than normal PCR method and had no reaction with other mink viruses. The developed LAMP assay was used to test 30 suspected mink samples resulting in a positive rate of 6.7%. The assay was simple，rapid，reproducible and may be considered as a routine method used in grass-roots labs.

mink；ADV；LAMP；detection；VP2 gene

S855.3

A

1005-944X（2015）06-0079-04