屈素潔，鄒聯(lián)斌，陳芳芳，張步嫻，胡 杰，莫勝蘭，施開創(chuàng)，李 軍，尹彥文

（廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530001）

應用熒光定量RT-PCR檢測J亞群禽白血病病毒

屈素潔，鄒聯(lián)斌，陳芳芳，張步嫻，胡 杰，莫勝蘭，施開創(chuàng)，李 軍，尹彥文

（廣西壯族自治區(qū)動物疫病預防控制中心，廣西南寧 530001）

針對J亞群禽白血病病毒（ALV-J）基因序列保守區(qū)域設計一對特異性引物和一條特異性探針，通過構建重組陽性標準質粒作為陽性標準品，建立了檢測ALV-J核酸的熒光定量PCR方法。優(yōu)化反應體系和條件后進行特異性、敏感性、重復性試驗。結果顯示，該檢測方法特異性強，與其它禽源病毒如A亞群禽白血病病毒（ALV-A）、B亞群禽白血病病毒（ALV-B）、新城疫病毒（ NDV）、禽流感病毒（AIV）、雞傳染性貧血病毒（CIAV）和馬立克病病毒（MDV）均不發(fā)生交叉反應；該方法可檢測到3.2×102拷貝/μL的病毒核酸，與常規(guī)RT-PCR相比，敏感性高100倍；重復性試驗的變異系數(shù)小于2%。研究結果表明，建立的Real-time RT-PCR 檢測方法特異性強、靈敏度高、可重復性好，可用于ALV-J的定量檢測。

J亞群禽白血病病毒；Taqman 探針；熒光定量PCR

禽白血病（avian leukosis，AL）是由禽白血病病毒（ALV）和禽肉瘤病病毒群病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱[1]。自禽白血病病雞中分離的有6個亞群，即A、B、C、D、E和J亞群。其中A、B、C、D、J亞群屬于外源性禽白血病病毒，具有致瘤性；E 亞群屬于內源性禽白血病病毒，沒有致瘤性[2-5]。J亞群禽白血病由J亞群禽白血病病毒（avian leukosis virus subgroup J，ALV-J）引起的一類禽類傳染性腫瘤疾病。據(jù)推測該亞群病毒為內源性ALV與外源性

ALV重組而來[6]。由于誘發(fā)腫瘤、患雞胴體廢棄、產蛋性能下降和其他未知的對雞群生產性能的影響，ALV-J給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經濟損失和嚴重威脅[7]。目前，尚無針對J亞群禽白血病的有效治療方法和疫苗，只能通過特異性診斷并淘汰陽性雞以及采取種群凈化措施來控制該病[8-9]。

目前常用的ALV-J檢測方法有病毒分離與鑒定、血清學試驗和分子生物學試驗等，這些方法在敏感性、特異性、時效性等方面均存在不足[10]。實時熒光定量RT-PCR（real-time RT-PCR）是近年來發(fā)展起來的一種新型PCR技術，既能定性檢測，也能定量檢測，且所需時間較短、敏感性較高，避免了傳統(tǒng)的RT-PCR后的檢測處理步驟，節(jié)省了時間和材料[11]，故很快得到了廣泛應用。本研究根據(jù)ALV-J基因序列保守區(qū)域設計特異性引物和探針，旨在建立一種快速、靈敏、特異的ALV-J Real-time RT-PCR檢測方法，為ALV-J的快速診斷和定量檢測提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料

J亞群禽白血病病毒（ALV-J）、A亞群禽白血病病毒（ALV-A）、B亞群禽白血病病毒（ALV-B）、新城疫病毒（ NDV）、禽流感病毒（AIV）、雞傳染性貧血病毒（CIAV）和馬立克病病毒（MDV）均由廣西區(qū)動物疫病預防控制中心保存。

1.2 主要試劑和儀器

One Step PrimeScript RT-PCR Kit（Perfect Real Time）、膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒、PMD 18-T Simple Vector均購自Takara公司；DH5α感受態(tài)購自Tiangen；其他試劑均為國產分析純。熒光定量PCR儀為ABI公司的ABI Step One Plus型。

1.3 引物與TaqMan探針的設計與合成

根據(jù)GenBank 收錄的ALV-J基因序列保守區(qū)域，設計1對特異性引物及相應的Taqman探針，上游引物：5′-GGAAGACCAAAGGCCATAAA -3′-A，下游引物：5′-CATAGCTTGACCCTGGGAAT-3′，探針序列：JOE- CACACACCACCGGGATTCCGBHQ1。擴增片段長度為129bp。將探針的5′端以熒光報告基團JOE標記；3′端以熒光淬滅基團BHQ1標記，引物和探針由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取與cDNA合成

參照RNA提取試劑盒說明書提取雞胚尿囊液中的RNA。

1.5 陽性標準模板的制備

將獲得的RNA進行PCR擴增，PCR反應體系如下：上、下游引物各5 pmol，dNTPs 5 nmol，10×Buffer 2μL，cDNA 2 μL，Taq DNA聚合酶0.5 U，加ddH2O至20 μL。PCR 反應條件為：95℃ 5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的DNA片段，將目的片段與pMD18-T載體16℃連接過夜，轉化DH5α感受態(tài)細胞，質粒經PCR鑒定陽性命名為ALV-P，用核酸蛋白分析儀測定陽性質粒濃度，并換算成拷貝數(shù)。

1.6 熒光定量RT-PCR方法的建立

1.6.1 熒光定量RT-PCR反應體系與反應條件的優(yōu)化

參考One Step PrimeScript RT-PCR Kit推薦的反應體系和條件，在相同濃度模板和反應體系中，采用矩陣法確定引物和探針的最佳濃度。在以上參數(shù)優(yōu)化的基礎上，進行熒光定量RT-PCR循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化，整個優(yōu)化過程綜合考慮Ct值、熒光強度、重復性等，確定反應條件。

1.6.2 標準曲線的建立

將陽性質粒標準品進行10倍梯度稀釋，取濃度為3.2×101～3.2×107拷貝/μL的標準品作為模板，根據(jù)優(yōu)化后的體系和條件進行Real-time RTPCR反應，建立標準曲線，并得出反應的擴增效率和曲線的相關性系數(shù)。

1.6.3 敏感性試驗

取濃度為3.2×101～3.2×107拷貝/μL的標準品作為模板，根據(jù)優(yōu)化后的體系和條件進行Realtime RT-PCR反應，同時以常規(guī)RT-PCR作為參比方法，檢測其靈敏度。

1.6.4 特異性試驗

對A亞群禽白血病病毒、B亞群禽白血病病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、雞傳染性貧血病毒和馬立克病病毒分別取等量樣品提取病毒RNA（或DNA），采用所建立的ALV-J Real-time RT-PCR 方法進行檢測。

1.6.5 重復性試驗

取5個10倍梯度稀釋的標準品，按所建立的Real-time RT-PCR方法分別進行批內、批間檢測的可重復性試驗。批內試驗檢測，每個濃度設3個重復；批間試驗進行3次獨立檢測，每次間隔10天，計算Ct值的平均值和變異系數(shù)（CV）。

1.7 臨床樣品檢測

對廣西區(qū)動物疫病預防控制中心收集、保存的221份歷年雞肺、氣管、脾臟等組織進行檢測。將提取出的病毒核酸分別進行ALV-J實時熒光RTPCR檢測和常規(guī)RT-PCR檢測，以評價其臨床實用性。

2 結果

2.1 質粒濃度的計算

測得陽性質粒的OD260/OD280=1.74，計算出質粒濃度為0.185μg/μL，其拷貝數(shù)為3.2×108拷貝/μL。

2.2 熒光定量RT-PCR方法的建立

2.2.1 熒光定量RT-PCR反應體系與反應條件的建立

經反應體系與反應條件的優(yōu)化，確定了最終反應體系與反應條件。反應體系為20μL：2×One Step RT-PCR Buffer Ш 10μL，Takara Ex Taq HS 0.4μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4μL，Rox Reference Dye Ⅱ（50×）0.4μL，上下游引物、探針各0.8μL，模板RNA 3μL，雙蒸水加至20μL。反應條件：反轉錄42℃/5 min；預變性92℃/10s；92℃/3s，55℃/30s（收集熒光）40個循環(huán)。

2.2.2 熒光定量RT-PCR標準曲線的建立

通過Real-time RT-PCR，得到檢測ALV-J的擴增曲線和標準曲線（圖1）。ALV-J Real-time RTPCR 標準品具有良好的線性關系（ 相關系數(shù)R2= 0.999，擴增效率E = 1.07）。

圖1 熒光定量RT-PCR檢測ALV-J標準曲線

2.2.3 特異性試驗結果

特異性試驗結果顯示，僅ALV-J出現(xiàn)擴增曲線，而ALV-A、ALV-B、NDV、AIV、CIAV、MDV和空白對照均無擴增曲線，說明針對ALV-J設計的檢測引物和探針特異性好。

2.2.4 熒光定量PCR的敏感性

經過檢測，確定Real-time RT-PCR 檢出的最低限為3.2×102拷貝/μL（圖2），常規(guī)PCR 的檢測極限為3.2×104拷貝/μL（圖3）。Real-time RT- PCR與常規(guī)RT-PCR相比，敏感性高100倍。

圖2 real-time RT-PCR 敏感性試驗

圖3 常規(guī)RT-PCR的靈敏度檢測

2.2.5 重復性試驗結果

取5個10倍梯度稀釋的標準品分別做3個組內重復和組間重復試驗，結果顯示（表1），批內試驗變異系數(shù)為0.41%～0.79%，批間試驗變異系數(shù)為0.51%～0.94%，均小于2%，表明所建立的Realtime PCR方法具有良好的可重復性。

表1 實時熒光RT-PCR的重復性

2.3 臨床樣品檢測

利用建立的熒光定量RT-PCR方法，對保存的廣西地區(qū)收集的221份病料核酸進行檢測，結果顯示，檢出ALV-J 14份，陽性率為6.33%，檢測結果與RT-PCR結果一致。

3 討論

目前，禽白血病病毒J亞群對世界養(yǎng)禽業(yè)造成了極大的危害和損失，但仍沒有有效的治療方法，及時檢測、凈化種群是控制本病的主要手段。目前主要采用病理組織學、血清學、PCR等方法檢測和診斷ALV-J。但是病理組織學法檢測操作復雜，費時費力；血清學檢測方法易受外界條件干擾；傳統(tǒng)的PCR無法進行定量分析，無法確切檢測出機體內病毒的增殖狀態(tài)。Real-time RT-PCR是將普通PCR通過標準曲線對未知模板進行分析，進而實現(xiàn)PCR技術從定性到定量的飛躍?；赥aqMan探針的實時熒光PCR不僅具有快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，而且由于該法采用引物和探針的“雙保險”，因此特異性更強，可避免PCR技術帶來的假陽性反應。

本研究建立的實時熒光定量RT-PCR檢測ALV-J的方法，特異性好，只從ALV-J陽性病料中檢測到特異性的擴增信號，不與檢測的其他常見家禽傳染病發(fā)生特異性反應。試驗所建立的標準曲線的相關系數(shù)R2=0.999，擴增效率E = 1.07，說明核酸拷貝數(shù)的對數(shù)值與Ct值之間有極顯著的線性關系，優(yōu)化的體系和條件很好地滿足了試驗要求。重復性試驗得出組內和組間變異系數(shù)為0.41%～0.94%，說明此方法具有很好的準確性和重復性，可以穩(wěn)定地用于ALV-J核酸的定量檢測。該試驗中建立的曲線可檢測到3.2×102拷貝/μL的初始模板量，檢測敏感性比常規(guī)RT-PCR提高100倍以上。檢測量大，一次可以檢測96份樣品，整個反應都在密閉系統(tǒng)內進行，避免了樣品間的污染。檢測速度快，從樣品處理包括RNA的提取，PCR等到試驗結束，只需4個小時，比其他的血清學檢測方法節(jié)省了時間，準確性高。Taq Man探針只與特異性的模板發(fā)生反應，假陽性率低，與SYBR Green I相比，不需要考慮引物二聚體和其他非特異性擴增。

綜上所述，本研究建立的J亞群禽白血病病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好、能夠準確定量等優(yōu)點，為快速檢測病原和定量檢測病毒含量提供了必要的技術平臺。

[1] Saif Y M . 禽病學[M].蘇敬良，高福，索勛，譯. 11 版.北京：中國農業(yè)出版社，2005.

[2] 李佳桃，崔寶玉，岳華，等.熒光定量 RT-PCR 檢測禽白血病病毒方法的建立及應用[J].中國動物檢疫，2008 ，25（9）：25-28.

[3] Calnek B W. Disease of Poultry [M].Ames，Iowa，USA：Iowa State University Press， 1991：334-380.

[4] 何愛飛，徐春志，雷云華，等. 蛋雞血管瘤型禽白血病的診斷[J].動物醫(yī)學進展，2009，30（1）：112-115.

[5] 成子強，趙振華，郝永清，等. 禽白血病病毒J亞群（ALV-J）的血清學調查及PCR 診斷[J] .中國病毒學，2002，17（4）：324 -329.

[6] Li Y H，Liu X M，Xu C G，et al. Isolation，identification，and phylogenetic analysis of two avian leukosis virus subgroup J strains associated with hemangioma and myeloid leukosis[J].Vet Microbiol，2013，166（3/4）：356-364.

[7] Gao Y N，Liu Y Z，Zhu H B，et al. Differential expression of immune-related cytokine genes in response to Jgroup avian leukosis virus infection in vivo[J].Mol Immunol，2013，187（2）：278-283.

[8] Saif Y M. Diseases of Poultry[M].12thed. Oxford in England：Blackwell Publishing ，2008：514-568.

[9] 崔治中，郭惠君，孫淑紅.雞白血病的流行現(xiàn)狀和防制對策 [C]//.中國畜牧獸醫(yī)學會2009學術年會論文集（上冊）.石家莊：中國畜牧獸醫(yī)學會，2009：268 -275.

[10] 杭柏林，胡建和，李杰，等. J 亞群禽白血病病毒檢測方法的研究進展[J].中國農學通報，2011，27（32）：21-24.

[11] 袁亞男，劉文忠.實時熒光定量PCR技術的類型、特點與應用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（3）：27-30.

Development and Application of a Real-time RT-PCR Assay for Avian Leukosis Virus Subgroup J

Qu Sujie，Zou Lianbin，Chen Fangfang，Zhang Buxian，Hu Jie，Mo Shenglan，Shi Kaichuang，Li Jun，Yin Yanwen
（Guangxi Center for Animal Disease Control and Prevention，Nanning，Guangxi 53001）

A pair of specific primers and a specific probe was designed according to the ALV-J conserved gene sequence and a plasmid containing the target gene was constructed as a standard control. A real-time PCR assay was developed for detection of ALV-J. After optimization of the reaction conditions，the assay was tested for its specificity，sensitivity and repeatability. Result showed that the assay was highly specific and there were no cross-reactions with other avian pathogens including ALV-A，ALV-B，NDV，AIV，CIAV and MDV. The assay had a detection limit of 3.2×102copies/μL viral RNA，100 times more sensitive than the conventional PCR，and its coefficient of variations was less than 2% in the reproducible test. The results indicated that this real-time RT-PCR assay was of high specificity，sensitivity and reproducibility，and could be used for the quantitative detection of ALV-J.

ALV-J；Taqman probe；Real-time PCR

S8562.65+7

A

1005-944X（2015）06-0056-05

廣西區(qū)水產畜牧獸醫(yī)局科技項目（桂漁牧科1204935）

尹彥文