尹偉力，梁君妮，林 超，張四化，岳志芹，劉 葒

（1. 煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺 264000；2. 山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266000；3. 深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518000；4. 武漢市重大動物疫病防控中心，湖北武漢 430003）

病毒性出血性敗血癥病毒液相芯片檢測技術(shù)的建立

尹偉力1，梁君妮1，林 超2，張四化4，岳志芹2，劉 葒3

（1. 煙臺出入境檢驗檢疫局，山東煙臺 264000；2. 山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266000；3. 深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518000；4. 武漢市重大動物疫病防控中心，湖北武漢 430003）

為建立檢測病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）的液相芯片快速檢測技術(shù)，用DNAStar軟件對Gen-Bank中VHSV的G基因進行序列分析，設(shè)計VHSV特異性引物并標(biāo)記生物素。探針氨基化修飾并與熒光編碼微球偶聯(lián)后與VHSV RT-PCR產(chǎn)物雜交反應(yīng)，用液相芯片儀器檢測熒光信號。結(jié)果表明液相芯片檢測體系能夠正確檢出VHSV。病毒核酸的最低檢出量為10pg，檢測特異性高，說明初步建立了檢測VHSV的液相芯片技術(shù)，為VHSV的檢測提供了新方法。

病毒性出血性敗血癥病毒（VHS）；液相芯片；檢測

病毒性出血敗血癥病毒（viral hemorrhagic septicemia of salmonids virus，VHSV）感染魚類引起的病毒性出血敗血癥，又稱鱒魚腹水病、新鱒魚病等[1]。病原是一種彈狀病毒，能引起魚類急性或慢性內(nèi)臟性疾病，死亡率非常高[2]。

病毒性出血敗血癥在歐洲流行已久，法國、意大利、瑞士、挪威、瑞典、波蘭等歐洲國家均有正式報導(dǎo)[3]。近年來，該病已蔓延至在北美洲、大洋洲、東南亞等區(qū)域[4-5]。

VHSV主要感染鱒魚及其他鮭科魚類，對其他養(yǎng)殖類非鮭科魚苗也有影響[6]。通常當(dāng)水溫降至

10℃左右時，魚群就會發(fā)病[7]。出血性敗血癥的主要病理變化為組織器官出血、變性、壞死。肝、腎是靶器官，細胞出現(xiàn)空泡化或固縮化[8]。

細胞分離是檢測VHSV的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法操作復(fù)雜、檢測周期長[9-10]。因此，建立快速、高通量的檢測方法，成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迫切需要解決的問題。液相芯片技術(shù)是一種新型快速檢測技術(shù)，該方法集流式細胞術(shù)、納米熒光微球、熒光信號數(shù)字處理和傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)為一體[11-15]，其優(yōu)勢在于所需樣本量少，檢測周期短，既可檢測核酸也可檢測抗體[16]。本試驗采用RT-PCR檢測方法與液相芯片檢測技術(shù)結(jié)合，建立了VHSV的液相芯片快速檢測方法，為VHSV的檢測提供了又一種方法。

1 材料與方法

1.1 毒株核酸

病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、流行性造血器官壞死病毒（EHNV）和傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）核酸均由深圳出入境檢驗檢疫局友情提供；鯉春病毒株（SVCV）由本實驗室保存。

1.2 試劑與設(shè)備

表面羧基化的熒光編碼微球、鞘液、甲基咪唑（TE）、碳二亞胺購置美國BD公司；TMAC（temtrameihyl-ammdnium chloride）、Tris、SDS（10% solution）、鏈霉菌抗生物素蛋白－藻紅蛋白（SAPE）購自美國Sigma公司；SPAE Streptavidin-R-phycoerythrin購自美國Prozyme公司；RNA提取試劑盒（Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0）、RT-PCR試 劑 盒（RT-PCR Kit II）、DL2000 marker購自大連寶生物公司。

BD FACSArray液相芯片儀（FACSArray美國BD公司）；Eppendorf Mastercycler Gradient梯度PCR擴增儀（EP Gradient德國Eppendorf公司）；AlphamagerTM2200凝膠成像系統(tǒng)（2200美國AP公司）；Eppendorf高速冷凍離心機（5417R 德國Eppendorf公司）等。

1.3 引物探針的設(shè)計

通過Internet登陸美國國立生物信息技術(shù)中心（NCBI），查詢檢索已公布的VHSV G基因序列（JF781265.1），利用軟件DNA Star 7.0找出兩種病毒基因中最為保守的堿基作為液相芯片檢測探針。利用Primer Premier5.0軟件在探針上、下游設(shè)計一對引物。上、下游引物5’端進行生物素標(biāo)記；探針5’端進行氨基化修飾（表1）。

表1 引物及探針序列

1.4 RT-PCR反應(yīng)體系的建立

采用RNA提取試劑盒（大連寶生物公司）提取VHSV RNA。RT-PCR擴增的反應(yīng)體系：在0.2mL PCR反應(yīng)管中，依次加入10×RT-PCR buffer 2.5μL、dNTP（各2.5mmol/L）2.5μL、10pmol/μL F1 0.5μL、10pmol/μL R1 0.5μL、Inhibiter 0.5μL、AMV XL 0.5μL、AMV Taq（5U/μL）0.5μL、25mmol/L MgCl25.0μL、總RNA 3.0μL，加入雙蒸水使反應(yīng)體積達到25μL。以上反應(yīng)體系中，除了引物、總RNA和雙蒸水，其它組分均為RT-PCR試劑盒的組分。

優(yōu)化并確定RT-PCR擴增的反應(yīng)程序：50℃30min；94℃ 2min；94℃ 30s、58℃ 30s、72℃30s，30個循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保溫。

擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠圖像分析系統(tǒng)上觀察、分析擴增產(chǎn)物。

1.5 液相芯片檢測體系的建立

1.5.1 寡核苷酸探針與微球共價偶聯(lián)

①將微球漩渦混合20s充分分散；取3×106個微球（75μL），于1.5mL離心管中10000g離心1min，去上清；

②加入50μL 0.1mol/L甲基咪唑溶液（pH4.5），漩渦混合，超聲波處理（30s-1min）；

③加入氨基化探針1.0nmol，漩渦混合；

④加入2.5μL碳二亞胺溶液（10mg的碳二亞胺粉末加入1.0mL的滅菌純水，現(xiàn)用現(xiàn)配）充分混勻，室溫避光孵育30min。

⑤重復(fù)④一次。

⑥加入1.0mL 0.02% Tween-20，混勻，10000g離心1min，棄上清；

⑦加入1.0mL 0.1% SDS，混勻，10000g離心1min，棄上清；

⑧用0.1mol/L甲基咪唑溶液（pH4.5）100mL重懸微球，2～8℃避光保存，待用。

1.5.2 雜交

雜交體系包括：1.5μL探針偶聯(lián)微球，33μL 1.5×TMAC 雜交液，14.5μL TE，2.5μL RT-PCR產(chǎn)物，空白孔以5μL TE取代PCR產(chǎn)物。混合均勻后于98℃變性10min，在52℃溫度下孵育15min，18000g離心2min 去上清；加入50 μL用1×TMAC 雜交液稀釋的SA-PE（1∶500），選定溫度下孵育10min，18000g離心2min 去上清；加入50μL 1×TMAC 雜交液，漩渦混合使微球重懸，上機分析。

雜交溫度的優(yōu)化，雜交反應(yīng)時間在15min條件下，根據(jù)探針的Tm值，選48℃、50℃、52℃、54℃、56℃等5個溫度梯度為研究對象，考察不同雜交溫度下液相芯片的檢測效果。

1.6 液相芯片檢測體系重復(fù)性驗證

將VHSV的RT-PCR產(chǎn)物用于液相芯片檢測試驗，做3個重復(fù)，計算變異系數(shù)。

1.7 液相芯片檢測體系特異性驗證

將IPNV、SVCV、IHNV、EHNV、VHSV的RT-PCR產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物，用液相芯片檢測體系進行檢測。判斷整個液相芯片檢測體系對非目標(biāo)物有無檢測信號。

1.8 液相芯片檢測體系靈敏度驗證

將VHSV病毒核酸進行10倍系列稀釋，得到10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1等 不同稀釋度的稀釋液，用已經(jīng)建立的液相芯片檢測體系進行檢測，用于考察整個檢測體系的靈敏度。

1.9 樣本檢測

用建立的方法對32份實驗室保存的樣品進行檢測，與世界動物衛(wèi)生組織《水生動物疫病診斷手冊》推薦的PCR法[17]對比，評價其準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 PCR體系的建立

將VHSV RNA作為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電流分析，結(jié)果顯示擴增出大小為191bp左右的目的條帶，與預(yù)期擴增的片段大小一致（圖1）。

圖1 VHSV RT-PCR電泳結(jié)果

2.2 液相芯片檢測體系的建立

2.2.1 雜交溫度優(yōu)化

參與計數(shù)的熒光編碼和微球均在100個以上（圖2a），表明用于計算的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的熒光強度中位值（MFI）可信，3個熒光編碼微球的空白對照MFI值均小于500，試驗可進行結(jié)果判斷。試驗結(jié)果表明48℃～56℃之間，熒光變動幅度都不大，顯示52℃雜交良好，高于54℃時，檢測熒光下降劇烈，因此最佳雜交溫度選為52℃。

2.2.2 液體芯片檢測體系確立

液相芯片定性比值結(jié)果（LQRR）等于樣品校正后的MFI值（MFIS）與空白對照MFI平均值（MFIB）的比值，即LQRR＝MFIS/MFIB。如果LQRR≥3，判定為陽性樣本；如果2≤LQRR＜3，則判定為可疑；如果LQRR＜2，則判定為陰性。參與計數(shù)的熒光編碼微球均≥100個，表明用于計數(shù)的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的MFI值可信，各個熒光編碼微球的空白對照MFI均＜500，表明結(jié)果有效，試驗可以進行結(jié)果判定。

從圖2b、c、d看出，偶聯(lián)微球的探針與

VHSV RT-PCR產(chǎn)物在Red-A、Yellow-A檢測通道下均有熒光信號，表明VHSV液相芯片構(gòu)建成功。

圖2 VHSV液相芯片檢測結(jié)果

2.3 液相芯片檢測體系的重復(fù)性驗證

將提取的VHSV RNA進行RT-PCR擴增，然后在完全相同的條件下，用所建立的液相芯片體系進行三次檢測，用以驗證該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性，計算各批次間檢測的平均熒光強度值的變異系數(shù)，結(jié)果顯示變異系數(shù)在5.3%以內(nèi)，表明該方法具有良好的可重復(fù)性。

2.4 液相芯片檢測體系的特異性驗證

分別以VHSV、SVCV、IHNV、EHNV和IPNV的RT-PCR產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物模板，進行液相芯片檢測。結(jié)果（表2）表明，對目標(biāo)病毒的檢測結(jié)果均為陽性，而對非目標(biāo)病毒的擴增產(chǎn)物的檢測值均為陰性，表明所建立的方法具有很好的特異性。

2.5 液相芯片檢測體系的靈敏性驗證

將VHSV核酸進行10倍系列稀釋，得到10-8、10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1等 不同稀釋度的稀釋液，用已經(jīng)建立的液相芯片檢測體系進行檢測，靈敏度檢測結(jié)果如表3所示，檢測VHSV 最低限量為10pg。液相芯片法比PCR要靈敏。

表2 液相芯片檢測體系特異性驗證

表3 液相芯片檢測體系靈敏度驗證

2.6 樣本檢測

對32份實驗室保存的樣品檢測結(jié)果（表4）顯示，4份樣品為陽性，包括2份煙臺鱸魚、1份榮成黃顙魚及1份上海鱸魚。該法與OIE推薦的PCR方法檢測結(jié)果基本一致，但PCR檢測結(jié)果中有1份陽性樣品電泳譜帶較弱，較難辯別。

3 討論

本研究首次在國內(nèi)外建立了病毒性出血性敗血癥病毒的液相芯片快速檢測技術(shù)，可應(yīng)用于本病的快速檢測及流行病學(xué)調(diào)查等工作。

與傳統(tǒng)檢測方法相比，液相芯片技術(shù)集合了多種核酸擴增、液相微球雜交、激光等多種檢測技術(shù)，具有快速、簡便、高通量等優(yōu)點[18]。雜交與檢測過程中無需繁瑣的洗滌步驟，且整個反應(yīng)都在同一密閉反應(yīng)管中進行，避免了開蓋的交叉污染。與固相芯片相比，由于采用了流式懸浮微球雜交技術(shù)，其反應(yīng)更為高效，操作也更為靈活。與常規(guī)PCR方法相比，由于液相芯片檢測體系通過激光檢測核酸雜交微球的集合體，有效避免了多種核酸擴增產(chǎn)

物的相互干擾，提高了靈敏度。

液相芯片檢測的技術(shù)關(guān)鍵是設(shè)計多重擴增引物與探針[19]。本研究通過比對不同VHSV毒株的基因組序列，初步篩選多種引物，通過反復(fù)優(yōu)化，選定適合檢測VHSV的引物。在優(yōu)化探針實驗中發(fā)現(xiàn)，G、C堿基含量應(yīng)該在40%～60%，過少不易與PCR產(chǎn)物雜交，過多則會出現(xiàn)特異性雜交。探針內(nèi)部的互補序列如果超過4個堿基則會出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此外，探針的每個堿基必須與擴增產(chǎn)物一一配對，因此，在設(shè)計探針時應(yīng)選擇了VHSV高度保守的序列。

在方法建立過程中，本研究對雜交溫度選擇、碳二亞胺溶液濃度的最適濃度、探針與微球偶聯(lián)次數(shù)等進行了探索。通過多次實驗，發(fā)現(xiàn)雜交溫度的主要根據(jù)探針Tm值而確定，一般選擇Tm值上下各6℃范圍進行摸索。碳二亞胺溶液最合適濃度為10mg/mL，低于此濃度會影響偶聯(lián)。探針與微球偶聯(lián)次數(shù)在2～3次較為合適，如果偶聯(lián)不成功可以增加次數(shù)，但不要超過5次，否則本底值過高，會影響結(jié)果。同時研究表明，在分析結(jié)果時，首先要圈定微球范圍（如圖2a），盡量圈定微球集中地區(qū)域，分散于其他位置的微球可以忽略不計，否則會造成結(jié)果的偏差。

由本實驗中對32樣品臨床檢測結(jié)果可知，液相芯片檢測結(jié)果與傳統(tǒng)PCR方法基本一直，但PCR檢測結(jié)果中有1份樣品電泳帶較弱，肉眼較難辯別，而液相芯片檢測結(jié)果為陽性，說明靈敏度比傳統(tǒng)PCR方法高。所建立的液相芯片檢測體檢測VHSV最低限量為10pg。

本方法能夠?qū)Σ《拘猿鲅詳⊙Y病毒進行快速檢測，從樣品處理到出結(jié)果僅需2.5小時左右。由于采用了接近生物反應(yīng)體系的液相芯片系統(tǒng)和特異性的探針，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)檢測方法，大大杜絕了非特異性擴增造成的假陰性結(jié)果。采用了液相反應(yīng)體系，使該方法靈敏度高于PCR，避免了PCR檢測中溴化乙錠對人員和環(huán)境的污染，非常適合對進出境水生動物進行高通量檢測。

[1] 陳愛平，江育林，錢冬，等.病毒性出血性敗血病[J].中國水產(chǎn)，2011（2）：57-58.

[2] 安元龍，吳斌，林長軍.熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增（RTLAMP）技術(shù)在病毒性出血性敗血癥（VHS）診斷中的應(yīng)用[J].中國動物檢疫，2012，29（12）：21-26.

[3] Garver KA，Traxler GS，Hawley LM，et al. Molecular epidemiology of viral haemorrhagic septicaemia virus（VHSV）in British Columbia，Canada，reveals transmission from wild to farmed fish[J]. Dis Aquat Organ，2013，104（2）：93-104.

[4] Verrier ER，Ehanno A，Biacchesi S，et al. Lack of correlation between the resistances to two rhabdovirus infections in rainbow trout[J].Fish Shellfish Immunol，2013，35（1）：9-17.

[5] Pham PH，Lumsden JS，Tafalla C，et al. Differential effects of viral hemorrhagic septicaemia virus（VHSV）genotypes IVa and IVb on gill epithelial and spleen macrophage cell lines from rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）[J]. Fish Shellfish Immunol，2013，34（2）：632-640.

[6] 翁善鋼.病毒性出血性敗血癥的流行與診斷[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2014，35（2）：49-50.

[7] 倪穗，余曉巍，王建平，等.應(yīng)用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測魚類病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）[J].海洋與湖沼，2009，40（4）：489-493.

[8] 安元龍，吳斌，林長軍，等.熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增（RT-LAMP）技術(shù)在病毒性出血性敗血癥（VHS）診斷中的應(yīng)用[J].中國動物檢疫，2012，29（12）：23-25.

[9] 陳進會，陳文，黃偉，等.病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立[J].中國動物檢疫，2013，30（5）：42-45，46.

[10] 許建明，張念之，蔣一男，等.Taqman MGB探針快速定量檢測VHSV方法的研究[J].高技術(shù)通訊，2010，20（2）：208-213.

[11] Hulse R E，Kunkler P E，F(xiàn)edynyshyn J P，et al. Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue[J]. Neurosci Methods，2004，136（1）：87-98.

[12] Maskos U，Southern E M. A study of oligonucleotide reassociation using large arrays of oligonucleotides synthesised on a glass support. [J]. Nucleic Acids Res，1993，21（20）：4663-4669.

[13] Peterson A W，Wolf L K，Georgiadis R M. Hybridization of mismatched or partially matched DNA at surfaces[J]. J Am Chem Soc，2002，124（49）：14601-14607.

[14] Gotoh M，Hasegawa Y，Shinohara Y，et al. A new approach to determine the effect of mismatches on kinetic parameters in DNA hybridization using an optical biosensor[J]. DNA Res，1995，2（6）：285-293.

[15] Alam M. Diagnostic limitations to accurate diagnosis of cholera.[J].Clin Microbiol，2010，48（11）：3918 –3922.

[16] Bessede E，Delcamp A，Sifre E. New methods for detection of campylobacters in stool samples in comparison to culture[J]. Clin Microbiol，2011，49（3）：941-944.

[17] 世界動物衛(wèi)生組織.病毒性出血性敗血癥[M]. 水生動物疾病診斷手冊，2012版，2.3.9章，374-396. http：//www.oie.int/ international-standard-setting/aquatic-code/access-online/.

[18] Baums IB. Luminex detection of fecal indicators in river samples，marine recreational water and beach sand[J] Mar Pollut Bull 2007，54（5）：521-536.

[19] Liu J，Meng C，Zhang SH，et al. Multiplex reverse transcription PCR Luminex assay for detection and quantitation of viral agents of gastroenteritis[J]. Clin Virol，2011，50（4）：308-313.

Development of a Liquid Chip Technique for Detection of Viral Hemorrhagic Septicemia of Salmonids Virus（VHSV）

Yin Weili1，Liang Junni1，Lin Chao2，Zhang Sihua4，Yue Zhiqin2，Liu Hong3
（1.Yantai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Yantai，Shandong 264000；2. Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266000；3. Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518000；4. Wuhan Center for Major Animal Disease Control and Prevention，Wuhan，Hubei 430003）

In order to develop a liquid chip assay for detection of viral hemorrhagic septicemia of salmonids virus（VHSV），the G gene of VHSV in the GenBank was sequenced by using the software DNAStar 7.0 and specific VHSV primers labeled with biotin were prepared and coupled with fluorescence-coded microspheres. The aminationed probe was used for hybridization of VHSV PCR products，and a liquid chip detection technique for detection of VHSV was established by using BD FACSArray to detect fluorescence signal in the reaction system. The results showed that VHSV could be accurately detected by the developed liquid chip detection technique. The lower detection limit with this method was 10 pg of viral RNA，and the specificity of this method was very high．The study provided a new method for rapid and high throughput detection of VHSV.

viral hemorrhagic septicemia of salmonids virus（VHSV）；liquid chip assay；detection

S941.41+3

A

1005-944X（2015）06-0064-05

公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目201210055-4；科技部十二五支撐項目2013BAD12B02；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目2012IK018