胡明華，江忠遠(yuǎn)，金 茜

（遵義師范學(xué)院黔北特色資源應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563002）

漆姑草多糖的提取及其含量的測定

胡明華，江忠遠(yuǎn)，金 茜

（遵義師范學(xué)院黔北特色資源應(yīng)用研究實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563002）

探討了漆姑草多糖提取及含量測定的方法。采用蒸餾水溶解乙醇沉降法提取漆姑草中的多糖，用苯酚-硫酸法測定其含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該方法簡單、方便、無污染，從漆姑草中提取的多糖含量高達(dá)20.19%。

漆姑草；多糖；含量；水提醇沉法

多糖物質(zhì)是很多中草藥的主要成分，生物活性較高，研究表明漆姑草水粗提物對人白血病K562細(xì)胞株具有較強(qiáng)的抑制作用[3]，具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，因此探討漆姑草多糖提取及含量測定的方法具有實(shí)際意義，可為漆姑草多糖藥應(yīng)用于臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

漆姑草購于遵義市中醫(yī)院，并經(jīng)遵義市中醫(yī)院孔蕾藥劑師及遵義師范學(xué)院衛(wèi)生院趙淑敏副主任醫(yī)師鑒定。

樣品經(jīng)低溫干燥后，用中藥粉碎機(jī)破碎，過70目篩，采用四分法縮分，存放于玻璃瓶中備用。

1.2 儀器與試劑

儀器：T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)（普析通用）；RE-2000E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（北京多利斯儀器有限公司）；HH-1恒溫水浴鍋（海浦東物理光學(xué)儀器廠）。

試劑：葡萄糖、苯酚、濃硫酸、氯仿、無水乙醇、丙酮、正丁醇、石油醚（bp：30～60℃）、95%乙醇均為分析純。

1.3 漆姑草多糖的提取方法

準(zhǔn)確稱取待用漆姑草70g于燒杯中，在25℃下用95%乙醇浸泡3次，每次浸泡時(shí)間為5h，95%乙醇用量依次為350mL、250mL、200mL。過濾，濾渣揮干溶媒后分三次加入蒸餾水400mL、250 mL、150 mL，于97℃水浴鍋中浸提，每次3h，合并濾液，減壓濃縮至150 mL。離心除去不溶物，過濾。濾液在攪拌下緩慢倒入95%乙醇至其醇濃度在80%左右，0～5℃靜置一天。過濾，分別用20mL無水乙醇、20mL丙酮沖洗沉淀，于40℃真空干燥一天，得灰色粗產(chǎn)物3.9446g。

將上述粗產(chǎn)物用150mL二次蒸餾水溶解，離心分離上層清液。上層清液用Sevage試劑（氯仿:正丁醇=4:1）脫蛋白6次，直至無明顯蛋白層[4-5]。收集上層透明液體，水浴蒸發(fā)至20mL，加入40mL無水乙醇醇析多糖，過濾。分別用20mL無水乙醇、20mL丙酮分多次沖洗沉淀，將沉淀物于40℃真空干燥一天得漆姑草多糖1.4381g。

1.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取105℃恒重的葡萄糖10mg，定量轉(zhuǎn)移至250 mL棕色容量瓶中，使其濃度為，用于漆姑草多糖的測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯酚-硫酸液的配制與測定波長的選擇

取分析純苯酚120g，在硫酸浴中蒸餾，收集180～182℃餾分。準(zhǔn)確稱取5.0g苯酚蒸餾物，用少量二次蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中定容，0～5℃冷藏備用。

在10mL具塞刻度試管中分別加入1.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、1.0mL苯酚儲備液，震蕩下加入5.0mL95%硫酸溶液，混勻后沸水浴加熱15min，冷至室溫，在450～510nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，其最大吸收峰波長為490nm（見圖2）。

圖1 最大吸收波長

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于7支10.0mL具塞刻度試管中，用二次蒸餾水稀釋至2.0mL，以2.0mL二次蒸餾水作空白試驗(yàn)。在具塞刻度試管中加入1.0mL苯酚儲備液，搖勻，震蕩下加入5.0mL95%硫酸溶液，搖勻后沸水浴加熱15min。冷至室溫，于490nm下測定其吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=0.01708C-0.00663，R2=0.9990（見圖2）。

圖2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 漆姑草多糖含量的測定

準(zhǔn)確稱取恒重后的漆姑草多糖10mg，用少量二次蒸餾水溶解后移入50mL棕色容量瓶中，定容。準(zhǔn)確量取該溶液2mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測定其吸光度，用回歸方程計(jì)算測定溶液中葡萄糖的濃度。

漆姑草多糖含量（%）=C×D×0.9/W×1000

式中：W為多糖的質(zhì)量（mg），C為漆姑草多糖溶液中葡萄糖的濃度為漆姑草多糖的稀釋因素：D=2×100/0.2=1000，0.9為葡萄糖校正系數(shù)。

由公式計(jì)算出提取的漆姑草多糖含量為20.19%。

2.4 紫外吸收光譜

取恒重后的漆姑草多糖l0mg，加適量二次蒸餾水溶解，用二次蒸餾水作空白，在200～600 nm范圍內(nèi)測定其吸收光譜（見圖4）。

圖3 紫外吸收光譜

由圖3可看出，漆姑草多糖水溶液在280nm處有微弱吸收，說明用Sevage法除蛋白后的多糖仍殘留有微量蛋白質(zhì)、多肽；但在260nm處無吸收現(xiàn)象，說明溶液中無核酸存在。

2.5 漆姑草多糖的性質(zhì)

漆姑草多糖恒重品為灰白色，無味，溶于熱水，不溶于試劑級的無水乙醇、環(huán)己烷、二甲苯、四氯化碳、環(huán)己酮等有機(jī)溶劑。Molish反應(yīng)有紫色環(huán)生成，苯酚-硫酸法呈陽性反應(yīng)。

3 結(jié)論

采用95%乙醇浸泡去除漆姑草中的生物堿、苷類、低聚糖等物質(zhì)，水溶醇析法提取多糖，Sevage法除蛋白，經(jīng)分光光度法測定漆姑草多糖含量為20.19%。

漆姑草多糖經(jīng)95%H2SO4酸化后水解為單糖，單糖脫水生成糠醛衍生物，最后和苯酚反應(yīng)生成有色物質(zhì)，顯色反應(yīng)穩(wěn)定。用紫外可見分光光度法檢測漆姑草多糖的含量，方法簡單、可靠。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編寫組.中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1994．

[2]黃筑艷,李焱.漆姑草揮發(fā)油成分的研究[J].長春師范學(xué)院學(xué)報(bào),2006,25(5):58-60．

[3]張素英,何林.漆姑草石油醚提取物化學(xué)成分分析及抗腫瘤活性篩選[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,38(28):15590-15591.

[4]田衛(wèi).植物多糖的研究[D].蘭州:蘭州大學(xué),2007．

[5]吳亞林.幾種天然生物活性多糖的化學(xué)研究[D].杭州:浙江大學(xué),2007．

（責(zé)任編輯：朱 彬）

On the Extraction and Determination of Polysaccharide in Sagina Japonica

HU Ming-hua，JIANG Zhong-yuan，JIN Qian
(The Application Research Lab for Featured Resources of Qianbei,Zunyi Normal College,Zunyi 563002,China)

This paper gives a full account of the extraction and determination of polysaccharide in Sagina Japonica.The study adopts the distilled water to dissolve ethanol to extract polysaccharide and then use phenol-sulfuric aid method to determine its content.The experiment shows that this method is simple and convenient,and the content of the polysaccharide reaches 20.19%.

Sagina Japonica;polysaccharide;content;water extraction and alcohol precipitation

O629.12

A

1009-3583（2015）-0102-03

2015-01-11

胡明華，男，貴州遵義人，遵義師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)師。