韓 嵐，季兆潔，陳衛(wèi)東，許 釩，尹登科，李珊珊，彭代銀

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是因腦血管病引起的認(rèn)知功能障礙，是阿爾茨海默病中最常見的類型之一，并已成為廣泛關(guān)注和探究的問題［1］。四物湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎組成，為養(yǎng)血補(bǔ)血的經(jīng)典方劑。近年來，四物湯在腦病的應(yīng)用方面不斷拓展［2－3］，尤其在治療 VD方面引起越來越來多的關(guān)注［4］，但其作用機(jī)制尚不十分明確。本研究采用大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注法復(fù)制VD大鼠模型，并從神經(jīng)遞質(zhì)、血管活性物質(zhì)、血液流變性3個(gè)方面闡明四物湯的作用機(jī)制，為篩選、開發(fā)治療VD的特色中藥方劑提供依據(jù)。

1 材料

1．1 藥材與試劑 熟地黃、白芍、當(dāng)歸、川芎購自北京同仁堂藥業(yè)有限公司，并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥與資源教研室鑒定。四物湯醇提物的制備：各藥材按復(fù)方配伍比例，加入10倍量75%的乙醇，回流提取2h后，濃縮配制成生藥含量為0．6g／mL和0．3g／mL的提取液備用。尼莫地平（批號(hào)131148）由亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，用時(shí)用蒸餾水配制成濃度為2mg／mL的藥液。大鼠乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、5－羥色胺（5－h(huán)ydroxy tryptamine，5－HT）、內(nèi)皮素－1（endothelin－1，ET－1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）檢測試劑盒均購于上海源葉科技有限公司。

1．2 動(dòng)物 健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（250±20）g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2011－0003。

1．3 儀器 Morris水迷宮系統(tǒng)：西班牙Panlab公司；AB－135型分析天平：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；MULTIFUGE X1R高速低溫離心機(jī)：Thermo美國；syzx6061正置顯微鏡：Nikon日本；GHX－9270B－1恒溫箱：上海福馬；BT－873型實(shí)驗(yàn)體內(nèi)血栓形成測定儀：包頭醫(yī)學(xué)院心血管研究室研制；Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀：美國 MD公司；LEICA RM2135切片機(jī)：湖北孝感市泰維電子有限公司；ZT－12M自動(dòng)脫水機(jī)、YB－7B石蠟包埋機(jī)：孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司。

2 方法

2．1 VD大鼠模型的復(fù)制 參照改良Longa法［5］，采用線栓法復(fù)制大腦中動(dòng)脈阻斷再灌注模型。首先采用Morris水迷宮法篩除靈活性差及視力障礙大鼠。將大鼠用水合氯醛（350mg／kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定，于頸部皮膚行常規(guī)縱行切口（約2．5cm），暴露并鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA），結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）分叉部并反向拉直ECA，距CCA末端約5mm處剪口，用直徑0．28mm的魚線沿頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）方向插入，深度由分叉部計(jì)算共（18．5±0．5）mm，于ICA近心端結(jié)扎該動(dòng)脈，全層縫合切口，2h后輕輕抽出魚線10mm實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈再灌注，術(shù)中室溫保持（22±2）℃。模型復(fù)制成功的判定標(biāo)準(zhǔn)：大鼠手術(shù)麻醉清醒后出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓，無力，站立不穩(wěn)，提尾時(shí)左側(cè)前爪內(nèi)旋。假手術(shù)組線栓插入深度小于9mm，不閉塞大腦中動(dòng)脈。

2．2 分組及給藥 將篩選出的大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、四物湯高劑量組、四物湯低劑量組、尼莫地平組，每組12只。除假手術(shù)組和模型組給予同容積生理鹽水外，給藥組每天灌胃給藥，四物湯高劑量組6g／kg，相當(dāng)于臨床劑量的8倍；四物湯低劑量組3g／kg，相當(dāng)于臨床劑量的4倍；尼莫地平20 mg／kg，相當(dāng)于臨床劑量的8倍。術(shù)后第2天開始給藥，給藥容積為10mL／kg，每日1次，連續(xù)給藥14d。

2．3 指標(biāo)檢測

2．3．1 行為學(xué)檢測 依據(jù)文獻(xiàn)［6］方法，采用 Morris水迷宮法進(jìn)行行為學(xué)研究。①定位巡航實(shí)驗(yàn)：術(shù)后第10天開始進(jìn)行Morris水迷宮測試，連續(xù)訓(xùn)練4d，每天從4個(gè)不同象限中點(diǎn)將大鼠放入水池（頭朝池壁），任其在水中游泳，讓其自行尋找平臺(tái)，爬上平臺(tái)后讓其在平臺(tái)上停留10s，以使其強(qiáng)化記憶效果，若在60s內(nèi)未能爬上平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)人員將大鼠引導(dǎo)至目標(biāo)平臺(tái)，同樣讓其在平臺(tái)停留10s。第5天將大鼠從平臺(tái)對(duì)側(cè)象限中點(diǎn)放入，記錄大鼠90s內(nèi)爬上平臺(tái)的時(shí)間，作為逃避潛伏期，若90s內(nèi)未能爬上平臺(tái)，潛伏期記為90s。②空間探索實(shí)驗(yàn)：定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24h，撤除平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將大鼠從原平臺(tái)對(duì)側(cè)象限中點(diǎn)放入，任其自由游泳90s，用影像記錄系統(tǒng)記錄大鼠穿過原平臺(tái)所在位置的次數(shù)及目標(biāo)象限時(shí)間百分比。

2．3．2 血液流變學(xué)指標(biāo)的測定 Morris水迷宮測試完成后，每組隨機(jī)取8只大鼠麻醉，由腹主動(dòng)脈取血5mL，測定各組大鼠的全血比黏度和血漿比黏度。

2．3．3 海馬組織中 AChE、5－HT、ET－1、VEGF含量測定 各組大鼠在取血后，于冰盤上迅速分離左、右側(cè)海馬，加入冰生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的腦組織勻漿。取海馬勻漿嚴(yán)格按照試劑盒說明書，以酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠海馬中AChE、5－HT、ET－1、VEGF的含量。

2．3．4 海馬組織病理學(xué)檢測 末次給藥后1h，每組取剩余4只大鼠，麻醉，迅速暴露心臟，用肝素化的生理鹽水100mL經(jīng)升主動(dòng)脈快速?zèng)_洗，然后用含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液灌注。斷頭取腦，置于10%福爾馬林中固定。24h內(nèi)常規(guī)石蠟包埋，冠狀切片，蘇木精－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。

2．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。多組間均數(shù)比較，采用單因素方差分析，采用LSD法（方差齊時(shí)）或DunnettT3（方差不齊時(shí)）進(jìn)行均數(shù)的多重比較；多組間數(shù)據(jù)分布比較，采用秩和檢驗(yàn)（Kruskal WallisH檢驗(yàn)）；兩組間數(shù)據(jù)分布比較，采用 Mann－WhitneyU檢驗(yàn)。P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0．05），穿越平臺(tái)次數(shù)和目標(biāo)象限距離百分比明顯減少（P＜0．05）。與模型組比較，各治療組逃避潛伏期均明顯縮短（P＜0．05），四物湯高劑量組和尼莫地平組目標(biāo)象限距離百分比明顯增加（P＜0．05）。各治療組穿越平臺(tái)次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。四物湯高、低劑量組這3個(gè)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見表1。

表1 各組大鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠水迷宮試驗(yàn)結(jié)果比較（±s）

注：同列含有相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＞0．05；同列不含相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＜0．05。

組 別 n 逃避潛伏期／s穿越平臺(tái)次數(shù)目標(biāo)象限距離百分比／%假手術(shù) 12 27．85± 8．96＊ 3．17±1．90＊ 39．92± 9．09＊模 型 12 49．58±14．52＃ 1．42±1．08＊ 20．86±11．49＃尼莫地平 12 29．84± 8．67＊ 2．58±1．98＊ 37．65±13．43＊◇四物湯高劑量 12 35．69±10．58＊◇ 2．25±2．67＊ 32．72±13．11＊◇四物湯低劑量 12 39．04± 8．84◇ 1．75±1．91＊ 29．54± 8．31＃◇

3．2 各組大鼠海馬 AChE、5－HT、ET－1和 VEGF含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬中AChE、ET－1含量均顯著升高（P＜0．05），5－HT含量顯著降低（P＜0．05），VEGF含量無顯著變化（P＞0．05）。與模型組比較，各治療組海馬中AChE含量顯著降低（P＜0．05），5－HT含量顯著增高（P＜0．05）；四物湯高劑量組和尼莫地平組海馬中ET－1含量顯著降低（P＜0．05），四物湯高劑量組VEGF含量顯著增高（P＜0．01）。四物湯高、低劑量組這4個(gè)指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見表2。

3．3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組全血黏度、血漿黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著升高（P＜0．05）。與模型組比較，四物湯高劑量組、尼莫地平組大鼠全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均明顯降低（P＜0．05）。四物湯高劑量組血漿黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)顯著低于四物湯低劑量組（P＜0．05）。見表3。

表2 各組大鼠海馬中AChE、5－HT、ET－1和VEGF含量比較（±s）

表2 各組大鼠海馬中AChE、5－HT、ET－1和VEGF含量比較（±s）

注：同列含有相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＞0．05；同列不含相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＜0．05。

假手術(shù) 8 0．62±0．04＊ 738．41±50．86＊ 8．13±0．97＊ 144．12± 6．88＊模 型 8 0．80±0．07＃ 583．22±74．36＃ 10．24±0．60＃ 155．82±13．25＊△尼莫地平 8 0．65±0．04＊ 687．16±52．81＊◇ 8．27±1．00＊◇ 167．88±13．72△四物湯高劑量 8 0．68±0．06＊◇ 707．56±52．60＊◇ 8．63±1．23＊◇ 178．59±13．51◇四物湯低劑量 8 0．71±0．03◇ 667．49±64．80◇ 9．27±1．49?！?170．58±24．00＊△◇

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：同列含有相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＞0．05；同列不含相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＜0．05。

假手術(shù) 8 7．72±1．41＊ 5．82±0．51＊ 4．38±0．59＊◇ 1．33±0．21＊ 3．98±0．55＊模 型 8 12．62±2．01＃ 7．07±0．73＃ 5．14±0．79＃ 2．27±0．30＃ 4．54±0．34＃尼莫地平 8 10．41±1．74◇ 6．14±0．60＊◇ 4．21±0．42◇ 1．65±0．27◇ 4．09±0．32＊四物湯高劑量 8 9．12±0．98＊◇ 6．11±0．88＊◇ 4．36±0．47＊◇ 1．52±0．11＊◇ 4．08±0．37＊四物湯低劑量 8 11．07±1．92?！?6．83±0．76＃◇ 4．91±0．38＊＃ 1．93±0．31△ 4．57±0．52＃

3．4 CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 假手術(shù)組可見海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞呈多層排列，且排列整齊緊密，分布均勻，結(jié)構(gòu)清晰，外形規(guī)則。模型組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂、稀疏，部分細(xì)胞胞體收縮呈多角形，胞漿濃縮，核固縮深染細(xì)胞多見，呈桿狀或三角形，核仁不明顯。各治療組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)均得到明顯的改善，錐體細(xì)胞僅有少量的缺失，有少數(shù)細(xì)胞核固縮，神經(jīng)纖維排列較為整齊，細(xì)胞形態(tài)基本趨于正常。見圖1。

4 討論

VD是指由一系列腦血管疾病導(dǎo)致的腦組織損傷而產(chǎn)生的進(jìn)行性智能障礙綜合征［7］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，VD主要與中樞膽堿能傳導(dǎo)通路受損，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)釋放異常，血管舒縮異常，大腦血液循環(huán)障礙等有關(guān)［8－9］。改善血液流變性質(zhì)，增加腦部血流量，改善腦微循環(huán)障礙，從而促進(jìn)腦組織神經(jīng)遞質(zhì)代謝對(duì)治療VD有著極其重要的意義。VD屬于中醫(yī)“健忘”“呆病”等范疇，而脈絡(luò)瘀阻、腦絡(luò)空虛、血不榮腦可使腦髓得不到氣血滲灌營養(yǎng)而使腦主神明的功能難以發(fā)揮，從而出現(xiàn)呆傻愚笨等一系列表現(xiàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示，四物湯對(duì)于VD模型大鼠具有較好的治療作用，其作用機(jī)制顯示多途徑、多環(huán)節(jié)特點(diǎn)。四物湯對(duì)改善血管功能、改變血瘀狀態(tài)顯示出良好的養(yǎng)血行血、活血生絡(luò)特點(diǎn)，提示四物湯針對(duì)脈絡(luò)瘀阻、血不榮腦為特點(diǎn)的VD有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。

四物湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，君藥熟地黃，味甘性微溫，具有滋陰養(yǎng)血、填精補(bǔ)髓的功效；臣藥當(dāng)歸，甘溫質(zhì)潤，長于補(bǔ)血養(yǎng)肝；佐以白芍，養(yǎng)血斂陰；使以川芎，活血行滯。四藥相伍，補(bǔ)血而不滯血，行血而不傷血。結(jié)合VD的病機(jī)研究，本實(shí)驗(yàn)從行為學(xué)、病理學(xué)考察了四物湯對(duì)VD大鼠的治療作用，從神經(jīng)遞質(zhì)、血管活性物質(zhì)、血液流變性3個(gè)方面對(duì)四物湯治療VD的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。目前常用的VD治療藥物為二氫吡啶類鈣拮抗劑尼莫地平。研究證實(shí)其能改善腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量［10］，松弛動(dòng)脈平滑?。?1］，擴(kuò)張全身小動(dòng)脈［11］，降低腦血管阻力［12］，改善腦血流狀態(tài)［12］，與四物湯的功能作用相近，故本實(shí)驗(yàn)選用尼莫地平作為陽性藥物。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，四物湯對(duì)VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力具有明顯的改善作用，能顯著改善VD大鼠海馬病理變化。ACh和5－HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)高級(jí)神經(jīng)功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其水平下降可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙［13－14］。其中 ACh可由其降解酶 AChE調(diào)節(jié)含量。本實(shí)驗(yàn)中，四物湯組可以通過調(diào)節(jié)海馬AChE和5－HT含量，改善VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。在血管活性物質(zhì)中，ET－1是目前認(rèn)為最強(qiáng)的縮血管肽，通過促進(jìn)血管進(jìn)一步收縮痙攣，加重腦缺血，還可能對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞造成直接損害［15］。而VEGF能通過促進(jìn)微血管新生來維系腦微環(huán)境穩(wěn)定和改善病理狀態(tài)下的微環(huán)境，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，這是脈絡(luò)滲灌氣血發(fā)揮對(duì)腦神經(jīng)營養(yǎng)作用的生物學(xué)基礎(chǔ)之一［16］。研究表明，四物湯在下調(diào)ET－1水平，上調(diào)血清VEGF水平方面有顯著優(yōu)勢，這表明四物湯改善VD的作用與其調(diào)節(jié)縮血管肽類ET－1含量，上調(diào)“血管生成”重要因子VEGF有關(guān)。血液流變學(xué)指標(biāo)的變化能夠反映出血流動(dòng)力學(xué)的改變，同時(shí)能間接反映出腦血管和腦血流量的基本狀態(tài)。當(dāng)血液呈高凝狀態(tài)，腦部血流量降低，能量代謝下降，最終導(dǎo)致血栓形成，并發(fā)展成為癡呆［17］。四物湯能夠降低血液黏稠度，改善腦循環(huán)，促進(jìn)腦組織代謝，顯示出良好的祛瘀生絡(luò)作用。

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