李宛蓉，桂雙英，2，3，王舉濤，王 鍵，4

（1．安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2．安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012；3．安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；

4．安徽省“115”新安醫(yī)藥研究與開發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，安徽 合肥 230012）

復(fù)方培元顆粒是由人參、黃芪、淫羊藿等多味中藥組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，是新安醫(yī)學(xué)流派傳人王鍵的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有固本培元、溫陽(yáng)益氣的功效，適用于癌癥患者因手術(shù)引起的虛證，以及化學(xué)治療后發(fā)生骨髓抑制、頭暈、乏力等不良反應(yīng)。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)復(fù)方培元顆粒的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為今后研究與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試劑

1．1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀（含在線真空脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器）；萬(wàn)分之一分析天平：梅特勒－托利多儀器上海有限公司；KQ2200型超聲波清洗器：昆山市儀器有限公司；UV757CRT紫外分光光度計(jì)；循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DZF－6050型真空干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

2 方法與結(jié)果

2．1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［1－3］復(fù)方培元顆粒臨床以湯劑形式應(yīng)用，且方中飲片主要有效成分多為皂苷和多糖類成分，均有較好的水溶性，所以本實(shí)驗(yàn)采用水煎煮法。以復(fù)方中總多糖、人參皂苷Rb1和淫羊藿苷總含量與出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)表對(duì)加水量（A）、提取時(shí)間（B）及提取次數(shù)（C）進(jìn)行優(yōu)選。因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2．2 飲片吸水率考察 稱取按處方比例混合的飲片52g，共3份，分別加入10倍量水（520mL）浸泡至透心，濾過(guò)，量取剩余水的容積，計(jì)算吸水率，結(jié)果平均吸水率為115%。因此，第1次煎煮時(shí)加水量應(yīng)增加至1．15倍。

2．3 干膏得率測(cè)定 精密吸取正交試驗(yàn)水煎液適量，置已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于60℃真空干燥至質(zhì)量，迅速稱質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。

2．4 紫外分光光度法測(cè)定總多糖含量［4－5］

2．4．1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥48h的葡萄糖對(duì)照品50mg，用蒸餾水定容至50mL，搖勻，精密量取10mL，用蒸餾水稀釋至100mL，即得100μg／mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

2．4．2 供試品溶液的制備 按處方精密稱取飲片，制成0．086 7g／mL的提取液，量取適量，經(jīng)Sevag法（三氯甲烷∶正丁醇＝4∶1）脫蛋白，樣品液與三氯甲烷－正丁醇的體積比為4∶1，分取上清液，加無(wú)水乙醇至含醇量達(dá)80%，冷藏24h，5 000r／min離心30 min，取沉淀，用10mL丙酮洗滌3次，揮干，沉淀加水溶解，定容至100mL，即得。

2．4．3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 吸取一定量的供試品溶液，顯色后在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，供試品的最大吸收峰位于488nm波長(zhǎng)處，故本試驗(yàn)選用488nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

回家后皮皮媽給皮皮爸做工作：“老公啊，你還是獻(xiàn)身吧，你的女兒都去看別人的雞雞了！”經(jīng)過(guò)皮皮媽的思想工作，皮皮爸有些改變，答應(yīng)第二天做好準(zhǔn)備后讓女兒看。

2．4．4 線性關(guān)系考察 精密吸取100．0μg／mL的葡萄糖對(duì)照品溶液0、0．4、0．6、0．8、1．0、1．2mL于6只試管中，分別加入蒸餾水補(bǔ)至2mL，然后分別加入5%苯酚溶液1．0mL，搖勻，迅速加入5．0mL濃硫酸，混勻后再將6只試管置于沸水中15min，取出后冷卻至室溫。在488nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。以吸光度（A）對(duì)葡萄糖濃度（c）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為c＝0．014 9A－0．037 5（r＝0．995 6）。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在20．0～60．0μg／mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2．4．5 精密度試驗(yàn) 精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液1．0mL，依法顯色后連續(xù)6次測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD＝1．70%，表明儀器精密度良好。

2．4．6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次供試品溶液，依法顯色后，在60min內(nèi)每間隔10min測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD＝1．84%，表明供試品溶液在60min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．4．7 重復(fù)性試驗(yàn) 分別吸取正交試驗(yàn)提取液6份，按照“2．4．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法顯色后測(cè)定吸光度。結(jié)果，吸光度的RSD＝1．12%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2．4．8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知多糖含量的提取液6份，加入葡萄糖對(duì)照品溶液適量，按“2．4．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量。結(jié)果表明，多糖含量的平均回收率為97．88%，RSD＝1．33%，表明該方法準(zhǔn)確可行。

2．5 高效液相色譜法測(cè)定人參皂苷Rb1與淫羊藿苷的含量［6－7］

2．5．1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rb1對(duì)照品與淫羊藿苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成含人參皂苷Rb1、淫羊藿苷分別為0．125、0．115mg／mL的混合對(duì)照品溶液。

2．5．2 供試品溶液制備 取提取液50mL，以150 mL水飽和正丁醇萃取3次（每次50mL），合并正丁醇液，再以100mL氨試液洗滌2次（每次50 mL）。正丁醇液蒸干，用甲醇定容至10mL量瓶中，搖勻，置于冰箱備用。臨用前過(guò)0．45μm微孔濾膜即得。

2．5．3 陰性樣品溶液制備 分別取缺人參藥材與缺淫羊藿藥材的提取液，按“2．5．2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液。

2．5．4 色譜條件 色譜柱為Phenomenex－C18（250 mm×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－水，梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1．0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2．5．5 陰性樣品干擾考察 精密吸取陰性對(duì)照溶液20μL，注入液相色譜儀，發(fā)現(xiàn)在人參皂苷Rb1對(duì)照品與淫羊藿苷對(duì)照品出峰的相應(yīng)位置上，陰性供試品無(wú)相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，表明樣品中的其他成分不干擾人參皂苷Rb1與淫羊藿苷的測(cè)定。見圖1。

2．5．6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、10、16μL，注入液相色譜儀中，按“2．5．4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（x）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得人參皂苷Rb1與淫羊藿苷的回歸方程分別為y1＝619．24x1－2．036 5（r＝0．999 9）和y2＝2 825．8x2＋26．723（r＝0．999 9）。結(jié)果表明，人參皂苷Rb1和淫羊藿苷分別在0．125～2μg、0．115～1．84μg范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

2．5．7 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2．5．4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1與淫羊藿苷的RSD分別為1．5%和1．4%，表明該方法精密度良好。

2．5．8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批提取物6份，按“2．5．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1與淫羊藿苷的RSD分別為1．9%和1．7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2．5．9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12h進(jìn)樣，依法測(cè)定。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1與淫羊藿苷的RSD分別為1．3%和1．9%，表明供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2．5．10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一樣品6份，加入人參皂苷Rb1與淫羊藿苷對(duì)照品溶液適量，按“2．5．2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算人參皂苷Rb1的含量和淫羊藿苷的加樣回收率。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1與淫羊藿苷的平均回收率分別為97．6%、96．8%，RSD分別為1．8%、1．4%，表明該方法準(zhǔn)確可行。

2．6 正交試驗(yàn)方法與結(jié)果 分別按處方稱取兩倍量的飲片52g，按照L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)平行3次。按照“2．4．2”和“2．5．2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別測(cè)定總多糖含量，人參皂苷Rb1與淫羊藿苷總含量與出膏率，并按照以下評(píng)分方程計(jì)算其綜合評(píng)分：綜合評(píng)分＝干膏得率／最大干膏得率×30＋（人參皂苷Rb1含量＋淫羊藿苷總含量）／最高含量×35＋總多糖含量／總多糖最高含量×35。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。采用一般線性模型進(jìn)行方差分析，考察因素A、B、C對(duì)綜合評(píng)分的主效應(yīng)。結(jié)果（表5）顯示，因素A和C的主效應(yīng)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），因素B的主效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。各因素的影響大小依次為C＞A＞B，且 C3＞C2＞C1，A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，而B1與B3相差不大。綜合比較后，確定A3B1C3為復(fù)方培元顆粒的最佳提取工藝，即12倍量水，提取3次，每次1h。

2．7 驗(yàn)證試驗(yàn) 分別按處方稱取飲片共104g，3份，按照最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，分別測(cè)定干膏得率、總多糖含量、人參皂苷Rb1含量與淫羊藿苷含量。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)選的復(fù)方培元顆粒的提取工藝切實(shí)可行。見表6。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)

表4 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果的描述性統(tǒng)計(jì)

表5 正交試驗(yàn)方差分析表

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方培元顆粒最佳提取工藝為加12倍量水、提取3次、每次提取1h。在實(shí)際生產(chǎn)中，提取3次的成本較高，但方中含有人參等名貴中藥材，本著充分利用名貴中藥材和尊重實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原則，選擇提取3次。

紫外－可見分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)波長(zhǎng)為200～760nm的電磁波的吸收特性所建立起來(lái)的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。在利用紫外可見分光光度法測(cè)總多糖含量時(shí)，應(yīng)保證操作的規(guī)范性和一致性，以減少測(cè)量誤差。

［1］鄭禮娟，秦昆明，蔡皓，等．多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選白術(shù)芍藥散提取工藝［J］．中國(guó)中藥雜志，2013，38（10）：1504－1509．

［2］王開林，張紹楓．人參黃芪有效成份提取的最佳工藝［J］．黑龍江醫(yī)藥，2003，16（4）：280－281．

［3］趙遠(yuǎn)，張凡，曲勝軍．人參主要成分藥理研究進(jìn)展［J］．亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8（11）：171－174．

［4］白雪媛，孫立霞，常桂娟，等．參維軟膠囊中皂苷類成分和總多糖的含量測(cè)定［J］．中國(guó)藥房，2013，24（23）：2155－2158．

［5］梁學(xué)政，陳惠紅，唐勇琛，等．正交試驗(yàn)優(yōu)選弱視明口服液的提取工藝［J］．中國(guó)藥房，2011，22（31）：2914－2916．

［6］趙亮，呂磊，紀(jì)松崗，等．高效液相色譜法快速測(cè)定人參中8種主要皂苷類成分的含量［J］．第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29（12）：1507－1510．

［7］韓麗萍，陳行愉，鄧偉民．HPLC法同時(shí)測(cè)定補(bǔ)腎壯骨顆粒中淫羊藿苷及柚皮苷含量［J］．中成藥，2011，33（1）：184－186．