王麗娜，賈學(xué)鋒，吳生兵，王 鍵，袁亞美，胡建鵬

（1．安徽中醫(yī)藥大學(xué)新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038；2．安徽省第二人民醫(yī)院中醫(yī)科，安徽 合肥 230011；3．安徽中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，安徽 合肥 230012）

腦卒中古稱(chēng)中風(fēng)，新安著名醫(yī)家汪石山認(rèn)為中風(fēng)總由中氣虧敗、風(fēng)邪乘虛所襲而致，其邪可在腑、在臟、在經(jīng)，治療上組方運(yùn)用靈活。汪氏《醫(yī)學(xué)原理》所載治風(fēng)之劑體現(xiàn)了祛風(fēng)豁痰、補(bǔ)氣養(yǎng)血的根本大法，對(duì)臨床辨風(fēng)用藥均有指導(dǎo)意義。中藥蜈蚣始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans（L．）Koch）的干燥體，臨床應(yīng)用已有悠久歷史。具有祛風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)的功能，用于肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、痙攣抽搐、小兒驚風(fēng)、中風(fēng)口 、半身不遂、破傷風(fēng)、風(fēng)濕頑痹、偏正頭痛、瘡瘍、瘰疬、蛇蟲(chóng)咬傷，為常用中藥［1］。臨床將其用于復(fù)方制劑中治療腦卒中，有良好療效［2］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，蜈蚣提取液能通過(guò)降低局灶性腦缺血再灌注大鼠血漿假血友病因子（von Willebrand factor，vWF）和血小板生成素（thrombopoietin，TPO）的含量，改善腦缺血再灌注造成的損傷［3］。本實(shí)驗(yàn)采用線(xiàn)栓大腦中動(dòng)脈復(fù)制局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)蜈蚣提取液對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶腦紅蛋白（neuroglobin，NGB）的影響，探討其改善腦缺血的作用機(jī)制。

1 材料

1．1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠36只，4月齡，體質(zhì)量250～300g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（蘇）2002－0031。將其隨機(jī)分為模型組、假手術(shù)組、蜈蚣提取液低、中、高劑量組和益氣活血方組。

1．2 藥物及試劑 益氣活血方（腦絡(luò)欣通）水煎濃縮劑：主要由黃芪30g，三七、川芎各10g，蜈蚣2條等組成，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑室制備，相當(dāng)于原生藥6．0g／mL。蜈蚣提取液由安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心制備，將蜈蚣研粉，采用先醇提后水提的方法將蜈蚣提取 液 濃 縮 成 所 需 中 劑 量 組 濃 度 （35g／L）［3］。NGB抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)bs－1859R。SP免疫組織化學(xué)試劑盒（批號(hào)K116812）及聯(lián)苯二胺顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2．1 模型復(fù)制與神經(jīng)缺損功能評(píng)分 參考Longa等［4］提出的大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓法，復(fù)制和評(píng)價(jià)局灶性腦缺血再灌注動(dòng)物模型，假手術(shù)組僅作頸動(dòng)脈分離，其余各組腦缺血2h后再灌注14d，再灌注結(jié)束后立即進(jìn)行神經(jīng)缺損功能評(píng)分，2～3分者入選。

2．2 治療方法 4個(gè)藥物治療組大鼠均在局灶性腦缺血再灌注模型復(fù)制后第2天開(kāi)始給藥，連續(xù)14 d。益氣活血方組按8．54g／kg（相當(dāng)成人臨床用量7倍）灌胃給藥，蜈蚣提取液高、中、低劑量組分別按0．70、0．35、0．175g／kg（分別相當(dāng)于成人臨床劑量14、7、3．5倍）灌胃給藥，假手術(shù)組、模型組予等容積生理鹽水灌胃給藥。

2．3 取材 連續(xù)給藥14d，末次給藥后12h，將各組大鼠用10%水合氯醛（3．6mL／kg）腹腔注射麻醉，打開(kāi)胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導(dǎo)管，快速注入肝素化生理鹽水，至右心耳流出液變清，再注入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），灌流固定30min后，斷頭取腦，除去小腦和腦干，取大腦，放入固定液中固定，脫水、透明、浸蠟，從視交叉前后連續(xù)制作腦部冠狀切片。

2．4 NGB檢測(cè) 將石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，采用高壓修復(fù)，當(dāng)高壓鍋慢慢噴氣時(shí)，計(jì)時(shí)2min，自然冷卻，蒸餾水水洗，PBS洗2min（共3次），3%H2O2室溫孵育6min，PBS洗2min（共3次），滴加一抗兔抗鼠（1∶100），4 ℃過(guò)夜，PBS洗2min（3次），滴加二步法二抗通用工作液，室溫20min，PBS洗2min（3次），聯(lián)苯二胺顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明，封片。

2．5 圖像處理 根據(jù)大鼠腦缺血半暗帶定位方法［5］，將大腦中動(dòng)脈阻塞的同側(cè)額頂葉皮質(zhì)上部界定為半暗帶觀察區(qū)，Olympus BX51熒光顯微鏡進(jìn)行定位攝片，免疫組織化學(xué)染色后，顯微鏡下400倍視野觀察，NGB陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿和胞核中有棕黃色顆粒表達(dá)。每張切片取2～3個(gè)視野進(jìn)行拍片，采用JD－801顯微圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的陽(yáng)性面積和平均吸光度進(jìn)行分析。

2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 13．0for windows軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。探索性分析發(fā)現(xiàn)，各單元的數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布。由于這是多因素非均衡設(shè)計(jì)的組合實(shí)驗(yàn)，按研究目的分成3個(gè)組合。①假手術(shù)組和模型組：采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；②模型組和蜈蚣提取液高、中、低劑量組：采用單因素方差分析，均數(shù)之間多重比較采用LSD檢驗(yàn)。③蜈蚣提取液高、中、低劑量組和益氣活血方組：采用單因素方差分析，均數(shù)之間多重比較采用LSD檢驗(yàn)或Dunnett'sT3檢驗(yàn)。顯著性水準(zhǔn)為α＝0．05。

3 結(jié)果

3．1 各組大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶的組織形態(tài)比較 假手術(shù)組大鼠額頂葉皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞分布均勻，各層排列整齊，胞核、胞膜正常，血管無(wú)明顯擴(kuò)展，間質(zhì)無(wú)水腫，膠質(zhì)細(xì)胞未見(jiàn)明顯增生。模型組大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶腦水腫，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增生。蜈蚣提取液高、中、低劑量組及益氣活血方組大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶中變性、壞死的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生增多。見(jiàn)圖1。

3．2 各組大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶中NGB表達(dá)水平比較

3．2．1 模型因素對(duì)大鼠額頂葉缺血半暗帶中NGB表達(dá)的影響 假手術(shù)組可見(jiàn)大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶中NGB表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞的胞漿和胞核，也可見(jiàn)少量膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。兩組NGB表達(dá)的陽(yáng)性面積和平均吸光度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表1和圖2。

表1 模型因素對(duì)大鼠額頂葉缺血半暗帶中NGB表達(dá)的影響（±s）

表1 模型因素對(duì)大鼠額頂葉缺血半暗帶中NGB表達(dá)的影響（±s）

假手術(shù)6 13．43±1．71 0．283±0．099 6 12．43±1．56 0．273±0．120模 型

3．2．2 蜈蚣提取液的量效關(guān)系考察 模型組與蜈蚣提取液低、中、高劑量組NGB表達(dá)陽(yáng)性面積和平均吸光度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（陽(yáng)性面積：F3，20＝36．597，P＝0．000；平 均 光 密 度：F3，20＝3．980，P＝0．022），以蜈蚣提取液高劑量組 NGB表達(dá)陽(yáng)性面積最高，平均吸光度最低。結(jié)果提示，蜈蚣提取液對(duì)NGB表達(dá)水平的影響具有明顯的量效關(guān)系。見(jiàn)表2、圖2。

表2 蜈蚣提取液對(duì)腦缺血再灌注大鼠額頂葉缺血半暗帶NGB表達(dá)影響的量效關(guān)系考察（±s）

表2 蜈蚣提取液對(duì)腦缺血再灌注大鼠額頂葉缺血半暗帶NGB表達(dá)影響的量效關(guān)系考察（±s）

注：同列含有相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＞0．05；同列不含相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＜0．05。

模型 6 13．43± 1．71＊ 0．283±0．099＊蜈蚣提取液低劑量 6 26．29± 6．98＃ 0．227±0．040＊＃蜈蚣提取液中劑量 6 26．77± 2．99＃ 0．212±0．018＃蜈蚣提取液高劑量 6 59．47±13．88△ 0．177±0．015＃

3．2．3 全方（益氣活血方）和拆方（低、中、高劑量蜈蚣提取液）的效應(yīng)考察 益氣活血方組及低、中、高劑量蜈蚣提取液組大鼠額頂葉缺血半暗帶NGB表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（陽(yáng)性面積：F3，20＝10．948，P＝0．000；平 均 吸 光 度：F3，20＝7．728，P＝0．001）。益氣活血方組與低、中、高劑量蜈蚣提取液組NGB表達(dá)陽(yáng)性面積比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（方差不齊，Dunnett'sT3檢驗(yàn)，P＞0．05）；益氣活血方組與高劑量蜈蚣提取液組NGB表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），與低、中劑量蜈蚣提取液組 NGB表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見(jiàn)表3、圖2。

表3 全方（益氣活血方）和拆方（低、中、高劑量蜈蚣提取液）對(duì)腦缺血再灌注大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶NGB表達(dá)水平的影響±s）

表3 全方（益氣活血方）和拆方（低、中、高劑量蜈蚣提取液）對(duì)腦缺血再灌注大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶NGB表達(dá)水平的影響±s）

注：同列含有相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＞0．05；同列不含相同右上標(biāo)符號(hào)的組別比較，P＜0．05。

蜈蚣提取液低劑量 6 26．29± 6．98＊△ 0．227±0．040＊蜈蚣提取液中劑量 6 26．77± 2．99＊△ 0．212±0．018＊蜈蚣提取液高劑量 6 59．47±13．88?！?0．177±0．015＃益氣活血方 6 43．91±17．34△ 0．157±0．032＃

4 討論

缺血性腦卒中是指由于血管阻塞造成血液循環(huán)障礙而引起腦組織損傷的一組疾病。引起缺血性腦卒中的根本原因是供應(yīng)腦部血液的動(dòng)脈發(fā)生閉塞性病變而未能獲得及時(shí)而充分的側(cè)支循環(huán)，使腦組織的代謝需要發(fā)生供不應(yīng)求所致。缺血性腦卒中的發(fā)病率高于出血性腦卒中，占腦卒中總數(shù)的60%～70%。腦卒中發(fā)病率高、致殘率高和病死率高，50%～70%患者會(huì)遺留癱瘓、失語(yǔ)等殘疾［6］。

NGB是機(jī)體內(nèi)除血紅蛋白、肌紅蛋白外的另一種攜氧球蛋白，在2000年由Burmester等首次在人和小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)［7］。NGB具有攜氧與儲(chǔ)氧功能，能夠清除活性氧自由基與氮自由基，主要在腦組織中表達(dá)，廣泛分布在腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞，與氧的運(yùn)輸和儲(chǔ)存密切相關(guān)，能夠可逆性地結(jié)合氧，并特異性供給腦組織，是神經(jīng)系統(tǒng)氧的攝取、運(yùn)輸和利用等的重要環(huán)節(jié)［8］。NGB在腦缺氧的適應(yīng)性保護(hù)過(guò)程中起重要作用，亦說(shuō)明NGB可增加神經(jīng)細(xì)胞的氧供應(yīng)，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活和功能［9］。腦梗死的治療目標(biāo)主要是挽救缺血半暗帶損傷區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞，以前對(duì)腦缺血再灌注的主要防治是鈣拮抗劑、興奮性氨基酸拮抗劑和自由基清除劑等，新型攜氧球蛋白NGB的發(fā)現(xiàn)為缺血缺氧性腦病的研究提出了新思路，為臨床防治缺血性腦卒中和神經(jīng)退行性疾病，改善預(yù)后找到新途徑［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶NGB表達(dá)陽(yáng)性面積和平均吸光度與假手術(shù)組無(wú)明顯差異。其原因可能是假手術(shù)組僅做頸動(dòng)脈分離，沒(méi)有腦組織低氧造成NGB應(yīng)激性升高，模型組因?yàn)槟X組織低氧后缺乏及時(shí)的干預(yù)治療，NGB升高不明顯所致。本研究也發(fā)現(xiàn)，蜈蚣提取液低、中、高劑量組NGB表達(dá)陽(yáng)性面積較模型組顯著升高，平均吸光度較模型組明顯降低，具有明顯的量效關(guān)系，以高劑量蜈蚣提取液的效應(yīng)最顯著；低、中、高劑量蜈蚣提取液組和益氣活血方組NGB陽(yáng)性表達(dá)面積和平均吸光度比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示益氣活血方的全方及其拆方（單味蜈蚣）對(duì)NGB表達(dá)的效應(yīng)具有明顯差異，其中益氣活血全方與高劑量蜈蚣提取液的效應(yīng)相當(dāng)。組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于模型組大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶腦水腫及神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增生，蜈蚣提取液高、中、低劑量組，益氣活血方組大鼠額頂葉皮質(zhì)缺血半暗帶的組織形態(tài)學(xué)異常均較模型組顯著改善。而膠質(zhì)細(xì)胞增生，具有雙刃劍作用，一方面其分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能修復(fù)，同時(shí)以膠質(zhì)細(xì)胞替代壞死的神經(jīng)細(xì)胞；另一方面膠質(zhì)細(xì)胞增生過(guò)多，易形成膠質(zhì)疤痕，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)產(chǎn)生不利影響。說(shuō)明蜈蚣提取液可能通過(guò)增強(qiáng)局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶NGB表達(dá)，改善腦缺血再灌注造成的損傷。NGB在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)節(jié)功能可能是作為氧壓力感受器或作為末端氧化酶在微氧環(huán)境下加速糖酵解生成三磷酸腺苷的功能。

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