何瑞曦，黃天擎，陳 偉，黃亞萍，陳衛(wèi)東

（安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012）

丹皮酚（paeonol，Pae），又稱牡丹酚，主要是從蘿摩科植物徐長卿Cynanchumpaniculatum（Bunge）Kitagawa干燥根或全草和毛茛科芍藥屬植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr、芍藥P．lactifloraPall．的根皮中提取分離出來的活性成分，具有良好的抗炎抗過敏及抗感染作用。近年來越來越多的研究顯示，Pae也有著廣泛的抗腫瘤作用［1－3］，但Pae具有易揮發(fā)易氧化、水溶性差和生物半衰期短等缺點，影響其多種制劑的穩(wěn)定性和生物利用度［4］。1970年代前，國內(nèi)外大多研究Pae提取、分離及藥理作用，緊接著，國外開始用同位素示蹤技術(shù)對Pae在兔、鼠等動物及人體內(nèi)的吸收、代謝進行研究［5］。Pae化學名稱為2－羥基－4－甲氧基苯乙酮，結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。在水相中自動形成的閉合雙分子膜而內(nèi)部中空的環(huán)球形或者橢球型的單室或多室的締合結(jié)構(gòu)。其殼層內(nèi)外均是親水基團，夾在兩層親水基團中間的是疏水基團。其與脂質(zhì)體在某些方面具有相似之處，但NISVs是采用毒性甚低的非離子表面活性劑代替脂質(zhì)體中的磷脂而制成，比脂質(zhì)體更加穩(wěn)定，能改變抗癌藥物體內(nèi)藥物動力學特性，具有增加藥效，提高生物利用度及靶向性等巨大優(yōu)勢。另一方面NISVs的結(jié)構(gòu)與細胞膜的結(jié)構(gòu)相似，故其在生物膜模擬、藥物的封裝和靶向釋放、納米粒子的合成以及作微反應(yīng)器等方面有著重要的應(yīng)用價值。其次，NISVs是在脂質(zhì)體基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型靶向給藥系統(tǒng)，NISVs與脂質(zhì)體同屬微粒型給藥系統(tǒng)，除了兼?zhèn)渲|(zhì)體的許多優(yōu)點如生物相容性、細胞親和性、無免疫原性，還具有穩(wěn)定性好、價格低廉等優(yōu)勢。

本實驗以Pae為模型藥物，采用新型NISVs對其包裹，并且對所制NISVs的體外釋放行為進行了初步考察，可望為Pae體內(nèi)給藥提供一種新的劑型，以期改善Pae水溶性差、半衰期短、穩(wěn)定性低等缺陷。

1 儀器和試藥

非離子表面活性劑囊泡（non－ionic surfactantvesicles，NISVs）是Vaulerbegrhe在1970年代首次提出的概念［6］，其是由非離子表面活性劑和膽固醇島津高效液相色譜儀（包括 LC20－ABSPDM20A紫外檢測器及島津LC－solution色譜工作站）：日本島津公司；AB125－S型分析天平：德國梅德勒公司；紫外分光光度儀：日本島津公司；XW－80A渦旋混合儀：上海滬西儀器有限公司；Amicon Ultra－4超濾離心管：密理博（上海）貿(mào)易有限公司；SEM掃描電鏡：日本JEOL－6700F。Pae原料藥：西安瑞林生物科技有限公司，批號110802；Pae對照品：中國藥品生物制品檢定所，批號110708－200506；Span－60：天津市福城化學試劑公司；聚乙二醇硬脂酸酯：江蘇海安石化；膽固醇：上海潤潔化學試劑有限公司；甲醇：色譜純，上海星可生化有限公司；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 Pae聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）化NISVs的制備 通過前期預(yù)實驗考察，本實驗最終選擇乙醇注入法制備PEG化Pae NISVs，即將適量的膽固醇、PEG硬脂酸脂與適量的Pae溶于無水乙醇中，將上述溶液以1．0mL／min注入60mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（50℃，pH＝7．4）中，并不停攪拌，直至乙醇揮發(fā)完全。結(jié)果表明，在揮發(fā)過程中無較大顆粒生成，得一帶淡藍色乳光的液體，將所得混懸液以3 000r／min離心，依次過 0．45、0．22μm 的微孔濾膜，即得 Pae NISVs。

2．2 NISVs中Pae的含量測定

2．2．1 色譜條件 通過預(yù)實驗，確定色譜條件為COSMISIL C18柱（4．6nm×250nm，5μm），進樣量為20μL，流動相為甲醇－水（70∶30），流速為1．0 mL／min，檢測波長為274nm，柱溫30℃。

2．2．2 標準曲線的制備 精密稱取Pae對照品5 mg置50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得儲備液。精密吸取不同容積的該儲備液分別置于容量瓶中，用甲醇稀釋至濃度分別為0．02、0．1、0．5、1、5、10μg／mL，配成系列對照品溶液，按“2．2．1”項下色譜條件進樣，以質(zhì)量濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標，得回歸方程為y＝1．2×105x－1 695（n＝6，r＝0．999 9）。結(jié)果表明，在0．02～10．0μg／mL范圍內(nèi)，Pae溶液的濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2．2．3 精密度和回收率試驗 配制質(zhì)量濃度為0．05、5．0、8．0μg／mL的Pae標準液作為低、中、高3種濃度對照品溶液，按上述方法測定Pae的日內(nèi)和日間精密度，其RSD在2%以內(nèi)，回收率為98．9%～101．2%，結(jié)果符合方法學要求。

2．2．4 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，平行制備供試品溶液各6份，分別采用0．22μm的微孔濾膜過濾，按“2．2．1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算RSD小于2．0%，符合《中華人民共和國藥典》對回收率的分析要求。

2．3 Pae體外特性表征指標的測定

2．3．1 包封率測定 取 Pae－PEG－NISVs溶液1 mL加入至超濾離心管（分子量為100kD）中，3 000 r／min離心10min，取100μL濾液，加甲醇定容至5 mL，得游離藥物含量Wf。另取100μL Pae－PEGNISVs溶液，加甲醇定容至5mL，超聲10min后渦旋混勻，得藥物總量Wt。將Wf與Wt分別進樣測定，計算包封率。包封率＝（Wt－Wf）／Wt×100%。平行測定3次，結(jié)果包封率為56．74%。

2．3．2 NISVs粒徑及Zeta電位的測定 粒徑：取制得的Pae NISVs適量，采用蒸餾水稀釋相應(yīng)的倍數(shù)。在室溫條件下，用納米激光粒度儀測定其平均粒徑。Zeta電位：取制得的Pae NISVs適量，用蒸餾水適當稀釋后，用納米激光粒度儀在室溫下測定其電位。

2．4 Pae NISVs制備工藝的選擇 NISVs制備過程中工藝因素對其外觀、包封率等影響較大，故在工藝因素考察中以NISVs的包封率和多分散系數(shù)為評價指標。

2．4．1 反應(yīng)溫度的選擇 PEG化NISVs制備過程中溫度應(yīng)在類脂質(zhì)的相變溫度以上，才能保證體系處于均一狀態(tài)。本研究制備了35～65℃范圍內(nèi)Pae NISVs，結(jié)果見表1。

表1 不同溫度對NISVs包封率、多分散系數(shù)影響（n＝3）

由結(jié)果可知，溫度在40℃以下時，包封率較低，造成藥物析出，而且乙醇揮發(fā)較慢。但溫度在60℃以上時，膜流動性增加，造成藥物泄漏嚴重，綜合以上因素，最后將溫度控制在55℃為宜。

2．4．2 轉(zhuǎn)速的考察 在以上相同情況下，選擇轉(zhuǎn)速分別為400、800、1 000、1 200r／min，制備 Pae NISVs，結(jié)果見表2。

表2 攪拌速度對包封率、多分散系數(shù)的影響（n＝3）

由結(jié)果可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，包封率呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，粒徑分布均勻。但在實驗中發(fā)現(xiàn)，當轉(zhuǎn)速為2 000r／min時會有大量的泡沫形成，這不利于非離子表面活性劑與有機相充分接觸，不能達到有效的水合作用，不利于NISVs的形成，故本實驗選擇攪拌速度為1 600r／min。

2．4．3 攪拌時間的考察 在以上相同條件下，轉(zhuǎn)速為1 000r／min的情況下，選擇攪拌時間分別為1、2、3、4h制備Pae－PEG－NISVs，結(jié)果見表3。

表3 乳化時間對包封率、多分散系數(shù)的影響（n＝3）

由結(jié)果可知，隨著乳化時間的延長，多分散系數(shù)稍有減小，時間過短，有機相揮發(fā)不完全，包封率較小，2h后，包封率變化不大，綜合各項指標，本實驗選擇乳化時間為2h。

2．5 正交實驗對NISVs處方進行優(yōu)選 在單因素考察基礎(chǔ)上確定囊材為Span60、膽固醇和聚乙二醇－硬脂酸（polyethylene glycol monostearate，PEGSA），囊材溶劑為無水乙醇，水和介質(zhì)為PBS，水合溫度為60℃，水和時間為2h，攪拌速度為1 600 r／min。選擇對包封率影響較大的4個處方因素：PBS用量（A）、無水乙醇用量（B）、Span60∶膽固醇（C）、藥脂比（D），各取3個水平（見表4），以包封率為評價指標，按照正交設(shè)計表L9（34）安排實驗，每個實驗組合平行測定2次。實驗結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

以包封率為考察指標，由表5中R值可以得出，各因素的影響程度B＞C＞D＞A，由表6可得無水乙醇用量和Span60／膽固醇比值這兩因素對包封率有顯著影響，最優(yōu)處方為A1B3C3D3。按優(yōu)化處方制備Pae PEG化NISVs，結(jié)果表明，制備的Pae PEG化NISVs的包封率為56．74%，載藥量高達9．8%，高于正交設(shè)計中各處方的包封率。

2．6 重復(fù)性與穩(wěn)定性實驗 按上述正交設(shè)計最優(yōu)處方，以純水為水相，乙醇注入法制備Pae NISVs，重復(fù)制備所得NISVs性質(zhì)穩(wěn)定，包封率為56．7%，粒徑為166nm，Zeta電位為－17mV，RSD在5%以內(nèi)。將此NISVs溶液于室溫和4℃下冷藏保存0、1、2、3個月后分別取樣，觀察外觀并測定其Zeta電位、平均粒徑及包封率情況。結(jié)果顯示，室溫儲藏下包封率從56．7%下降到52．8%，粒徑及Zeta電位沒有明顯變化，而4℃下冷藏保存的囊泡包封率、粒徑及電位無明顯變化，基本能保持Pae NISVs原液的性質(zhì)。

2．7 Pae NISVs的粒徑分布及Zeta電位測定 本實驗所制備的泡囊平均粒徑為166nm，Zeta電位為－17mV。見圖2和圖3。

2．8 顯微形態(tài)觀察 取所制得的Pae NISVs涂于銅片表面，自然干燥后，置于掃描電鏡下觀察其顯微形態(tài)，所制得NISVs成大小均一的圓球形，見圖4。

表4 正交設(shè)計因素水平表

表5 L9（34）正交試驗結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

2．9 體外釋放試驗 采用透析法進行體外釋放實驗，使用脫氣的新鮮純化水（pH 值為6．8～7．0）作為釋放介質(zhì)［7］，精密稱取適量的PEG－Pae－NISVs置于預(yù)先處理過的透析袋（含1mL釋放介質(zhì)）中，扎緊袋口，放入500mL釋放介質(zhì)中，將試樣置于溶出試驗儀中，試驗在漏槽條件下進行，溫度控制在（37±2）℃，轉(zhuǎn)速為100r／min，于5、10、20、30、40、60、120、240、480、720min吸取1．0mL透析液，并及時補充等量恒溫的新鮮釋放介質(zhì)，樣品經(jīng)稀釋過濾后，以同成分同批釋放介質(zhì)為空白，使用高效液相色譜法測定釋放介質(zhì)中藥物濃度，計算累積釋放率，重復(fù)3批樣品，取平均值，并按下公式計算累積釋藥百分比 （cumulative release percentage，Q）。Q＝［Ci×V1＋（C1＋C2＋ …＋Ci－1）×V2］／M×100%。

式中C1、C2、Ci－1、Ci為分別為第1、2、i－1、i等時間點釋放介質(zhì)中Pae濃度；V1表示釋放介質(zhì)總?cè)莘e；V2表示所取的樣的容積。

釋放曲線見圖5。如圖所示，Pae溶液僅在30 min就釋放80%以上，而NISVs在180min才釋放出80%以上的藥物，非NISVs中Pae的釋放明顯有緩釋效果。

3 討論

NISVs的制備方法與脂質(zhì)體的制備方法相似，根據(jù)現(xiàn)有文獻報道來看，采用薄膜分散法制備NISVs較多，但是預(yù)實驗結(jié)果表明，薄膜分散法得到的NISVs雖然包封率較乙醇注入法稍高，但粒徑較大且穩(wěn)定性差，且難以放大到工業(yè)化生產(chǎn)中，薄膜分散發(fā)法和逆向蒸發(fā)法制備過程中大量使用有機溶劑，不僅造成環(huán)境污染，而且易造成有機溶劑殘留；而乙醇注入法工藝條件容易控制而且容易放大并適合工業(yè)化生產(chǎn)，但是該方法制得的NISVs粒徑較大、分布不均勻，本實驗最終通過改良的乙醇注入法，制得的Pae－PEG－NISVs，粒徑較小、分布均勻、包封率較高、穩(wěn)定性較好且設(shè)備要求低。

Span類是親油性表面活性劑，在其中加入親水性表面活性劑以改善NISVs的復(fù)溶能力，實驗結(jié)果表明，當加入親水性表面活性劑PEG時NISVs穩(wěn)定性有所改善，后期體外釋放實驗表明，PEG的加入對該制劑的緩釋效果有所幫助。國內(nèi)外有文獻報道，在NISVs制備過程中，膽固醇的存在不利于NISVs的穩(wěn)定［8］，原因可能是膽固醇作為膜穩(wěn)定劑，若加入量過大會和藥物競爭在膜上的結(jié)合位點，容易造成藥物的泄漏，降低包封率，故一些NISVs在制備時并不使用膽固醇，而本實驗表明，當處方中摒棄膽固醇時，藥物包封率會大大下降。原因可能在于膽固醇賦予雙分子層膜一定的剛性，進而改變生物膜的流動性，可以顯著抑制非離子表面活性劑中碳氫鏈的運動，降低膜的流動性；同時也可以有效防止NISVs由膠晶態(tài)向液晶態(tài)轉(zhuǎn)變，提高膜的穩(wěn)定性及藥物的保留率，降低藥物的泄漏進而提高藥物的緩釋及靶向性［9－12］。

平均粒徑及Zeta電位是評價納米載體體系質(zhì)量的重要指標之一，平均粒徑及其分布直接影響著分散體系的物理穩(wěn)定性及其在體內(nèi)的分布，Zeta電位直接關(guān)系到載體是否穩(wěn)定。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，粒徑和制備工藝相關(guān)性較大，在相同制備工藝下，改變處方對粒徑的影響不大。本實驗最優(yōu)處方下的Pae－PEG－NISVs的平均粒徑為166nm，粒徑分布（particle size distribution，PDI）為0．149，Zeta電位為－17mV。表明最優(yōu)處方下的Pae－PEG－NISVs粒徑較小，分布均勻，為后期的靶向性研究奠定理論基礎(chǔ)，Zeta電位說明該NISVs具有較好的穩(wěn)定性。Pae－PEG－NISVs屬于熱力學、動力學均不穩(wěn)定的膠體分散體系［13］。溫度是影響其穩(wěn)定性的主要因素之一。在4℃條件下30d以內(nèi)，Pae－PEG－NISVs粒徑、電位以及包封率基本不變，而在室溫中，只是Pae－PEG－NISVs的包封率略有下降，這也說明所制備的NISVs穩(wěn)定性較好。

包封率和載藥量是評價納米載體的重要指標。所制備Pae－PEG－NISVs的包封率雖無顯著性優(yōu)勢，但載藥量高達9．8%，這意味著消耗較少的膜材即可獲得該納米制劑，在實際生產(chǎn)中大大減少了高分子材料的浪費，較高的載藥量彌補了包封率稍低的不足，為將該制劑投入生產(chǎn)提供了可能。

Pae－PEG－NISVs體外釋放實驗也為后期的藥物代謝動力學實驗提供理論相關(guān)性。其在體外藥物的釋放都表現(xiàn)為起始階段的突釋相以及隨后階段的緩釋相。藥物從納米載體中釋放機制主要有以下三種形式，即擴散、溶蝕、生物降解［14－15］，從藥物釋放的機制來看，突釋的主要是吸附在載體表面的藥物通過物理擴散引起的［16］，而隨后的緩釋階段主要是通過載體材料的溶蝕或降解，包封在載體內(nèi)部藥物緩慢釋放的過程。也有研究認為，藥物釋放介質(zhì)的種類及釋放介質(zhì)的親和性影響著藥物的釋放［17］，同時釋放介質(zhì)的用量也會影響著藥物的釋放，一般情況下釋放介質(zhì)的用量是藥物飽和溶解度的3～10倍［18］。本實驗的研究結(jié)果表明：Pae原料藥釋放非?？欤?0min累計釋放率就達到90%以上，而Pae－PEG－NISVs中Pae的釋放相對較慢，180min累計釋放率達到81．32%。根據(jù)體外釋放實驗的結(jié)果可推測該載體進入體內(nèi)釋放藥物的情況，這將在后期藥物代謝動力學實驗中進行考察與驗證。

本實驗采用改進的乙醇注入法，利用非離子表面活性劑Span60、膽固醇、PEG－SA為囊材，以Pae為模型藥物，制備NISVs，并且以PEG硬脂酸15為親水片段接到膠體NISVs的表面，以期達到減少網(wǎng)狀內(nèi)皮組織的攝取、延長體內(nèi)循環(huán)時間、增加包封率的目的。通過包封率、粒徑和電位的測定等優(yōu)化出最佳的處方，研究了表面活性劑NISVs在模擬體液中的釋放行為。結(jié)果顯示，NISVs的最佳處方為Span60 80mg、膽固醇30mg、PEG15－SA 30mg、Pae 30mg，水相PBS（pH 值＝7．4）容積為60mL。體外釋放行為則表明，NISVs具有明顯的緩釋作用。用這種方法制備的PEG化Pae NISVs包封率為57．4%，保存在4℃下具有較高的穩(wěn)定性。NISVs制備方法簡便易行，同時兼具靶向作用，是一種極有前景的制劑，PEG化Pae的研制將為Pae等水難溶性及不穩(wěn)定的中藥活性成分的臨床應(yīng)用提供新思路。

［1］Ye JM，Deng T，Zhang JB．Influence of paeonol on expression of COX－2and p27in HT－29cells［J］．World J Gastroenterol，2009，15（35）：4410－4414．

［2］Fan L，Song B，Sun G，et al．Endoplasmic reticulum stress－induced resistance to doxorubicin is reversed by paeonol treatment in human hepatocellular carcinoma cells［J］．PloS One，2013，8（5）：e62627．

［3］Li N，F(xiàn)an LL，Sun GP，et al．Paeonol inhibits tumor growth in gastric cancerinvitroandinvivo［J］．World J Gastroenterol，2010，16（35）：4483－4490．

［4］Riley CM，Ren TC．Simple method for the determination of paeonol in human and rabbit plasma by high－performance liquid chromatography using solid－phase extraction and ultraviolet detection［J］．J Chromatogr，1989，489（2）：432－437．

［5］戴玉英，胡晉．丹皮酚兔體內(nèi)吸收試驗［J］．沈陽藥學院學報，1985，2（2）：106－108．

［6］Lin T，F(xiàn)ang Q，Peng D，et al．PEGylated non－ionic surfactant vesicles as drug delivery systems for Gambogenic acid［J］．Drug deliv，2013，20（7）：277－284．

［7］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典：二部［M］．北京：化學工業(yè)出版社，2010：附錄202．

［8］Honeywell－Nguyen PL，Arenja S，Bouwstra JA．Skin penetration and mechanisms of action in the delivery of the D2－agonist rotigotine from surfactant－based elastic vesicle formulations［J］．Pharm Res，2003，20（10）：1619－1625．

［9］Balakrishnan P，Shanmugam S，Lee WS，et al．Formulation andinvitroassessment of minoxidil niosomes for enhanced skin delivery［J］．Int J Pharm，2009，377（1－2）：1－8．

［10］Pham TT，Jaafar－Maalej C，Charcosset C，et al．Liposome and niosome preparation using a membrane contactor for scale－up［J］．Colloids and Surf B Biointerfaces，2012，94：15－21．

［11］Mahale NB，Thakkar PD，Mali RG，et al．Niosomes：novel sustained release nonionic stable vesicular systems：an overview［J］．Adv Colloid Interface Sci，2012，183－184：46－54．

［12］Gangwar M，Singh R，Goel RK，et al．Recent advances in various emerging vescicular systems：an overview［J］．Asian pacific journal of tropical biomedicine，2012，2（2）：S1176－1188．

［13］Gannu P Kumar，Pogaku Rajeshwarrao．Nonionic surfactant vesicular systems for effective drug delivery：an overview［J］．J Acta Pharmaceutica Sinica B，2011，1（4）：208－219．

［14］梅興國．微載體藥物遞送系統(tǒng)［M］．武漢：華中科技大學出版社，2009：21－22．

［15］張勇，李娟，肖波，等．PEG修飾水飛薊素脂質(zhì)體的制備及體外釋放研究［J］．藥學與臨床研究，2010，18（3）：239－242，246．

［16］Jia L，Shen J，Zhang D，et al．Invitroandinvivoevaluation of oridonin－loaded long circulating nanostructured lipid carriers［J］．Int J of Biol Macromol，2012，50（3）：523－529．

［17］Yuan H，Wang LL，Du YZ，et al．Preparation and characteristics of nanostructured lipid carriers for control－releasing progesterone by melt－emulsification［J］．Colloids and surf B：Biointerfaces，2007，60（2）：174－179．

［18］Cheboyina S，Wyandt CM．Wax－based sustained release matrix pellets prepared by a novel freeze pelletization technique：formulation and process variables affecting pellet characteristics［J］．Int J Pharm，2008，359（1－2）：158－166．