鄧文靜 李東瑞 楚廣磊 滕軍放（通訊作者）

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）是一種細(xì)胞生長因子。近幾年，國內(nèi)外的許多研究認(rèn)為G-CSF 具有神經(jīng)保護(hù)作用，所以推測G-CSF可能是治療腦缺血的有效措施。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）與天然G-CSF具有相同的生物學(xué)活性，更普遍的應(yīng)用于臨床。因此本研究采用rhG-CSF作為干預(yù)藥物，擬通過局灶性腦缺血再灌注模型，觀察腦缺血大鼠的神經(jīng)功能變化和血管再生的情況，進(jìn)一步研究rhGCSF的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 rhG-CSF 購自山東泉港藥業(yè)有限公司，CD105、VEGF兔抗鼠多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)動物分組與模型制備 健康雄性SD 大鼠，2～3個月，體質(zhì)量280～320g，由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)研究中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham 組）、生理鹽水對照組（Nacl組）、rhG-CSF治療組。每組又隨機(jī)分為缺血治療后24h、7d和14d時間點(diǎn)組，每一時間點(diǎn)均為6只大鼠。采用改良的Longa［1］方法制作大鼠大腦中動脈閉塞MCAO 模型，動物模型缺血90min時再灌注。于再灌注開始，治療組予rhG-CSF 50μg／（kg·d），腹部皮下注射，連續(xù)5d。生理鹽水對照組予等量生理鹽水。分別于治療后24h、7d、14d時進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。

1．3 神經(jīng)功能評分與病死率統(tǒng)計 每只動物分別于缺血再灌注治療后24h、7d、14d進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，具體方法采用chen等［2］制定的神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)（Nss）進(jìn)行，觀察rhG-CSF對腦缺血大鼠神經(jīng)功能的影響。

1．4 CD105、VEGF蛋白表達(dá)檢測 以10%水合氯醛將大鼠深度麻醉，斷頭取腦，以前囪為中心、冠狀面±1mm 腦片，每隔100μm 續(xù)作6μm 厚腦冠狀面石蠟切片。每只大鼠選5張大致相同部位計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，經(jīng)圖像分析系統(tǒng)得出積分光密度IOD，取其平均數(shù)。胞漿呈棕褐色著色者認(rèn)為免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17．0軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，病死率比較采用四格表χ2檢驗(yàn)。神經(jīng)功能評分比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Student Newman Keuls Test SNK和Least Significant Difference Procedure LSD法檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 rhG-CSF對MCAO 大鼠病死率的影響 制作NacL組動物模型39只大鼠，rhG-CSF 治療組共進(jìn)行24只動物模型制作，2組病死率比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見表1。

2．2 神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果 NaCl組和rhG-CSF 治療組大鼠麻醉清醒后精神萎靡，左側(cè)肢體癱瘓，表現(xiàn)為站立不穩(wěn)，或走路向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒。假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)此種情況。

缺血再灌注治療后24h，NaCl組和rhG-CSF 治療組較sham 組神經(jīng)功能評分上升，差異有顯著性（P＜0．05）。缺血再灌注治療后7d時，NaCl組和rhG-CSF治療組較sham 組神經(jīng)功能評分差異有顯著性（P＜0．05），rhG-CSF 治療組較NaCl組神經(jīng)功能評分差異有顯著性（P＜0．05）。缺血再灌注治療后14d 時，各組兩兩比較差異均有顯著性（P＜0．05）。見表2。

2．3 各組大鼠腦組織缺血半暗帶VEGF蛋白的表達(dá) 免疫組化結(jié)果可見在神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色著色，此即VEGF 陽性表達(dá)。sham 組可見少量VEGF表達(dá)，缺血再灌注治療后7d和14d，NaCl組VEGF陽性表達(dá)要高于sham 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），rhG-CSF治療組VEGF 陽性表達(dá)要高于sham 組和NaCl組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見表3、圖1。

表1 rhG-CSF對MCAO 大鼠病死率比較 ［n（%）］

表2 3組對大鼠神經(jīng)缺損評分比較 （±s，n＝6）

表2 3組對大鼠神經(jīng)缺損評分比較 （±s，n＝6）

注：以上數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布，方差具有齊性；與sham組比較，＊ P＜0．05，＊＊ P＜0．05；與NaCl組比較，△P＞0．05，△△P＜0．05

組別24h 7d 14d Sham 組0．50±0．55 3．50±0．55 3．33±0．52 NaCl組 8．50±0．55＊ 7．83±0．75＊ 7．83±0．75＊rhG-CSF治療組7．83±0．98＊＊△ 4．67±1．21＊＊△△4．50±0．55＊＊△△

表3 各組大鼠腦組織VEGF積分光密度比較 （±s，n＝6）

表3 各組大鼠腦組織VEGF積分光密度比較 （±s，n＝6）

注：以上數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)檢驗(yàn)，均符合正態(tài)分布，方差具有齊性；與sham 組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．05，較之NaCl組，△P＜0．05

△

圖1 各組大鼠腦組織VEGF蛋白的表達(dá)（SP，×400）A：sham 組；B：NaCl組；C：rhG-CSF治療組1：7d；2：14d，3：21d

2．4 CD105染色觀察各組大鼠腦組織毛細(xì)血管密度 免疫組化結(jié)果可見血管內(nèi)皮細(xì)胞中棕黃色顆粒沉積，即為CD105陽性表達(dá)。腦缺血再灌注治療后14d時，sham 組CD105染色顯示毛細(xì)血管稀疏，NaCl組毛細(xì)血管稍增多，可見膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，rhG-CSF治療組毛細(xì)血管明顯增多（P＜0．05）。見表4。

表4 各組大鼠腦組織CD105積分光密度 （±s）

表4 各組大鼠腦組織CD105積分光密度 （±s）

注：與sham 組比較，＊P＜0．05，與NaCl組相比，＊＊P＜0．05

組別24h 7d 14d Sham 組58．97±3．54 69．22±2．03 65．84±2．46 NaCl組 90．89±8．45＊ 110．32±10．15＊ 100．01±11．15＊rhG-CSF治療組 134．77±12．16＊＊ 133．29±13．46＊＊ 143．02±9．96＊＊

3 討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用rhG-CSF 治療腦缺血大鼠，觀察病死率發(fā)現(xiàn)，NaCl組病死率為53．8%，rhG-CSF 治療組病死率為25．0%，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。對腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評分顯示，缺血再灌注治療后7d 和14d 時，rhG-CSF治療組神經(jīng)功能較NaCl組神經(jīng)功能恢復(fù)較好。由此可見rhG-CSF能降低腦缺血大鼠病死率，提高神經(jīng)功能，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

血管內(nèi)皮生長因子VEGF（vascular endothelial factor）能促進(jìn)血管的新生與重建，是針對血管內(nèi)皮細(xì)胞最為特異的有絲分裂原。本實(shí)驗(yàn)中缺血再灌注治療后7d和14d，rhGCSF治療組VEGF 陽性表達(dá)要高于sham 組和NaCl組，。CD105（Endoglin）蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子家族中的一員，相較于其他血管標(biāo)記因子，CD105多表達(dá)在新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞中，較大的血管基本不表達(dá)，特異性好，常被作為新生血管的特異標(biāo)記分子之一［3］。本實(shí)驗(yàn)中CD105免疫組化結(jié)果可見血管內(nèi)皮細(xì)胞中棕黃色顆粒沉積，正常腦組織中，可以檢測微量的CD105，腦缺血再灌注治療后14d時，sham 組顯示毛細(xì)血管稀疏，NaCl組毛細(xì)血管稍增多，可見膠質(zhì)細(xì)胞浸潤，rhG-CSF治療組毛細(xì)血管明顯增多。由此可見rhG-CSF 能促進(jìn)缺血后腦組織VEGF 和CD105 的表達(dá)，標(biāo)志著血管再生，這種促進(jìn)血管再生作用能持續(xù)至腦梗死后14d，并且伴隨有神經(jīng)功能的好轉(zhuǎn)。與Lee等［4-6］研究結(jié)果一致。

G-CSF促進(jìn)血管再生的機(jī)制，目前認(rèn)為有可能通過促使骨髓間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞或者血管［7］，或通過促進(jìn)單核細(xì)胞向缺血區(qū)募集進(jìn)而促進(jìn)血管生成［8］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，G-CSF被認(rèn)為有可能通過旁分泌途徑刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）。

由以上結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，rhG-CSF能改善腦缺血后大鼠的神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與促進(jìn)血管再生有關(guān)。rhG-CSF作為一種新型的神經(jīng)保護(hù)藥物，有望成為腦缺血神經(jīng)保護(hù)研究的新方向。

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