劉 涓 孫 威

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院老年病科;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胸外科，武漢 430030)

肺癌是全球癌癥中導(dǎo)致死亡的最常見原因，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌總數(shù)85%左右［1］。雖然外科手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療NSCLC的方法有所改進(jìn)，但其治療的療效并不令人滿意。肺癌的發(fā)病除了與吸煙、環(huán)境等因素有關(guān)外，機(jī)體免疫失衡、生長因子通路失調(diào)也起著重要作用［2］。

有研究提示白介素-6(interleukin-6，IL-6)是NSCLC中關(guān)鍵的促腫瘤細(xì)胞因子。NSCLC患者血清中的IL-6水平較健康對照組明顯升高，腫瘤組織中IL-6表達(dá)水平與總生存率相關(guān)，IL-6是NSCLC患者預(yù)后不良的指標(biāo);另外，在NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、血管形成中IL-6均發(fā)揮促進(jìn)作用［3］。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是一種多肽類生長因子，能刺激腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡［4］。有研究證實在肺癌發(fā)展中，IGF-1與其受體IGF-1R結(jié)合、通過自分泌或旁分泌，促進(jìn)肺癌細(xì)胞分化、生長［4］。多項研究表明IGF-1可作為多種腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)志物［3］。有研究提示IL-6與IGF-1在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中存在相互作用［5］，IL-6通過激活I(lǐng)GF-1受體促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展［6］。然而，IL-6和IGF-1在肺癌組織是否具有表達(dá)相關(guān)性尚無研究。

本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測IL-6、IGF-1在非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織的表達(dá)，分析IL-6、IGF-1表達(dá)的相關(guān)性、及與臨床病理特征的關(guān)系。

材料和方法

1.材料

武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科收集150例非小細(xì)胞肺癌組織蠟塊，所有患者符合非小細(xì)胞肺癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)前未行放療、化療及靶向治療史，臨床資料和手術(shù)記錄完整。癌旁組織取自距腫瘤組織遠(yuǎn)端＞5cm肺組織共100例。150例肺癌患者中，男86例，女64例;腺癌74例，鱗癌76例;I-II期79例，IIIIV期71例。

2.檢測方法

2.1 試劑

IL-6兔多克隆抗體(21865-1-AP)，IGF-1兔多克隆抗體(20214-1-AP)購自Proteintech公司，免疫組化試劑盒購自武漢谷歌生物科技公司。

2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色及免疫組織化學(xué)染色

所有組織標(biāo)本收集后4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制成蠟塊存檔，常規(guī)連續(xù)切片4張后，1張進(jìn)行HE染色以判斷診斷和組織類型，2張進(jìn)行IL-6、IGF-1免疫組織化學(xué)染色，留1張備用。免疫組織化學(xué)嚴(yán)格按試劑盒操作說明進(jìn)行，切片脫水后放入抗原修復(fù)液，微波加熱至沸騰，加熱修復(fù)10-15分鐘，室溫冷卻后PBS沖洗，5%BSA封閉1小時，4℃下一抗孵育過夜。復(fù)溫后PBS沖洗，二抗室溫孵育1小時，PBS沖洗，DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明。設(shè)立PBS溶液代替一抗作為陰性對照組。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

由2位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片。IL-6、IGF-1陽性反應(yīng)均為細(xì)胞和(或)胞漿深黃色或棕黃色染色，在400倍鏡下隨機(jī)挑取5個視野，采用半定量結(jié)果判斷，分別對鏡下陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度給予評分。(1)陽性著色細(xì)胞數(shù):每張切片上觀察5個高倍視野(400×)，計數(shù)陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，76% ～100%為4分。(2)陽性著色強(qiáng)度:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(3)兩者計分相乘即為陽性等級:0分為陰性(－)，1－4分為弱陽性(+)，5－8分為陽性(++)，9－12分為強(qiáng)陽性(+++)。

3.統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Spearman檢驗。

結(jié) 果

1.IL-6、IGF-1在非小細(xì)胞肺癌組織的蛋白表達(dá)

肺癌組IL-6陽性表達(dá)率(84.00%)顯著高于癌旁正常組織(77.00%，P＜0.01)，肺癌組IGF-1陽性表達(dá)率(80.00%)顯著高于癌旁正常組織(72.00，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1，表1)。

2.IL-6、IGF-1在非小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

(1)吸煙指數(shù)≥400的患者腫瘤組織IL-6表達(dá)率顯著高于吸煙指數(shù)＜400者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，IL-6在腺癌陽性表達(dá)率93.24%，顯著高于鱗癌陽性表達(dá)率77.63%。(2)腫瘤低分化患者腫瘤組織IGF-1表達(dá)率顯著高于中、高分化水平腫瘤組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(3)III、IV期患者腫瘤組織IGF-1表達(dá)率顯著高于I、II期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(4)IL-6表達(dá)與年齡、性別、組織類型、分化程度、TNM分期均無明顯關(guān)系(P＞0.05)。(5)IGF-1表達(dá)與年齡、性別、吸煙指數(shù)、組織類型均無明顯關(guān)系(P ＞0.05)。

3.IL-6、IGF-1在非小細(xì)胞肺癌組織的表達(dá)的相關(guān)性

非小細(xì)胞肺癌組織中，IL-6陽性表達(dá)與IGF-1陽性表達(dá)之間呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 IL-6、IGF-1在150例非小細(xì)胞肺癌組織和100例癌旁正常組織的表達(dá)Table 1 Expression of IL-6 and IGF-1 in 150 NSCLC and 100 para-carcinoma samples.

表2 IL-6、IGF-1在150例非小細(xì)胞肺癌組織表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性Table 2 Correlation between the expression of IL-6，IGF-1 and the clinicopathological characteristics of NSCLC

表3 IL-6、IGF-1在150例非小細(xì)胞肺癌組織表達(dá)相關(guān)性Table 3 Correlation between the expression of IL-6，IGF-1 in 150 NSCLC.(Spearman’test)

討 論

肺癌目前仍是死亡率最高的惡性腫瘤［1］，目前肺癌的免疫治療和針對生長因子通路的靶向治療是研究的熱點，近年來的研究發(fā)現(xiàn)IL-6在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，并且與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)［7］。IL-6通過JAK激活STAT蛋白家族的磷酸化，其中STAT3是IL-6的信號傳遞的主要下游通路分子［7］。包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞均可分泌IL-6從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［8］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)IL-6在包括肺腺癌和肺鱗癌的非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)程度均較癌旁正常組織明顯增高，吸煙指數(shù)≥400的患者腫瘤組織IL-6表達(dá)率顯著高于吸煙指數(shù)＜400者，提示吸煙有可能促進(jìn)肺癌組織IL-6的分泌和表達(dá)，這與Chen等關(guān)于煙草所致肺癌中IL-6的作用研究結(jié)論是相似的［9］。

以表皮樣生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑為代表針對生長因子通路的靶向治療也是日前肺癌非手術(shù)治療的研究熱點，而IGF-1通路是生長因子通路中一個重要的明星通路［10］，已有多項研究提示IGF1通路異常與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)［11］。本研究檢測了150例非小細(xì)胞肺癌組織和100例癌旁正常組織發(fā)現(xiàn)，IGF-1在肺癌組織的陽性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于良性肺組織。腫瘤低分化患者腫瘤組織IGF-1表達(dá)率顯著低于中、高分化水平腫瘤組織，III、IV期患者腫瘤組織IGF-1表達(dá)率顯著低于I、II期患者，說明IGF-1在腫瘤組織局部的高表達(dá)提示了腫瘤更低的分化程度和更晚的分期，這提示IGF-1在肺癌組織過表達(dá)可能與腫瘤的惡性行為有關(guān)。

更重要的是，我們首次發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中，IL-6陽性表達(dá)與IGF-1陽性表達(dá)之間具有明顯的正相關(guān)，這提示IL-6通路和IGF-1通路之間可能存在重要的交叉作用。IGF-1與受體結(jié)合后，能磷酸化激活下游Akt通路，而有文獻(xiàn)報道Akt信號的下游分子NF-κB可以直接結(jié)合到IL-6的啟動子，進(jìn)而激活I(lǐng)L-6的基因表達(dá)［12］，這提示IL-6通路與IGF-1通路之間的交叉作用可能通過PI3K/Akt通路的激活實現(xiàn)，而這也是本課題組下一步的研究方向。另有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6通過激活I(lǐng)GF-1R進(jìn)而激活I(lǐng)GF-1通路，促進(jìn)前列腺癌的成瘤與進(jìn)展，而IL-6下游的STAT3通路是重要的交叉媒介［6］。這些證據(jù)結(jié)合我們的研究均提示，IL-6和IGF-1通路之間可能存在廣泛而復(fù)雜的正向調(diào)控關(guān)系。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)IL-6、IGF-1蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中明顯高表達(dá)，IL-6高表達(dá)與更高的吸煙水平相關(guān)，IGF-1高表達(dá)與更低的腫瘤分化程度和更晚的TNM分期有關(guān)，更重要的是，IL-6陽性表達(dá)與IGF-1陽性表達(dá)正相關(guān)，提示IL-6和IGF-1通路可能并非兩條獨(dú)立的促腫瘤通路，兩者之間可能存在重要交叉作用。許多研究［5，13］提示單一靶點的腫瘤分子治療無法提供有效的抑制效果，在非小細(xì)胞肺癌中，針對可能相互作用IL-6和IGF-1通路采取雙靶點甚至多靶點治療能為肺癌的非手術(shù)治療提供更有效的抑制策略。

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