李中文 吳 濤

(蚌埠醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系細(xì)胞生物學(xué)教研室，蚌埠 233030)

銀杏葉提取物(extract of ginkgo biloba，EGB)是從銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的葉中分離純化出來(lái)的提取物，主要成分有黃酮糖苷類(lèi)、萜烯內(nèi)酯類(lèi)等，銀杏內(nèi)酯B(BN52021)是其主要有效成份之一［1］，具有抗氧化和清除自由基的作用。

現(xiàn)有的研究表明銀杏葉提取物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用，如對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦損傷和臨床腦功能不全有較明顯的治療效果［2］。此外還發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B具有對(duì)抗肝纖維化，保護(hù)肝臟作用［3］。但是，EGB在體內(nèi)發(fā)揮保護(hù)作用的分子機(jī)制尚不明確。

本研究在大鼠肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系中通過(guò)缺氧建立體外凋亡模型，觀察EGB對(duì)肝細(xì)胞凋亡有無(wú)保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制，進(jìn)一步探討銀杏內(nèi)酯B對(duì)大鼠肝細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制。

材料和方法

1.材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD新生鼠鼠齡10d以內(nèi)，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑和儀器

EGB(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán))、Hoechst(美國(guó)MolecularProbes公司)、PI染色劑(美國(guó) Sigma公司)、Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞分析試劑盒(美國(guó)Pharmigen公司);倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、高效液相色譜儀(美國(guó)奧泰公司)、加樣槍(美國(guó)安捷倫公司)、FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton-Dickinson公司)。

2.方法

2.1 肝臟處理

1d齡SD新生大鼠，快速分離新生鼠肝臟，浸入D-hank液中，取肝臟并剪成約1mm3的碎塊，再用DHank液洗三次，并剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物。0.25%胰蛋白酶分次消化后自然沉淀，取上清液，加入冷DMEM終止消化，離心棄上清液，再加入DMEM洗去殘存胰蛋白酶，用DMEM(Gibco)+10%胎牛血清+抗生素培養(yǎng)液的培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，將細(xì)胞懸液以1×106個(gè)/ml的密度重新接種，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。適時(shí)更換培養(yǎng)液至72h細(xì)胞維持旺盛的代謝。經(jīng)上述處理獲得純度＞95%的肝細(xì)胞。

2.2 肝細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將肝細(xì)胞隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組(N組)、缺氧對(duì)照組(H組)、缺氧加EGB組1(B1組)、缺氧加EGB組2(B2組)、缺氧加EGB組3(B3組)。B1、B2、B3組于缺氧前加入銀杏內(nèi)酯B注射液(20mg/ml)，銀杏內(nèi)酯 B 的終濃度分別為 1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml。

2.3 缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型建立

取上述5組細(xì)胞，向其中4組緩慢充入95%N2+5%CO2混合氣10min，直至培養(yǎng)瓶中空氣被替代，肝細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，放入CO2孵箱中孵育12h后倒出培養(yǎng)液，D-Hanks液漂洗，0.25%胰蛋白酶消化，當(dāng)消化一定程度后加入5ml培養(yǎng)液終止消化，將消化下來(lái)的細(xì)胞分別1500r/min 10min離心收集，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，參照Annexin V-FITC試劑盒說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，確定缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型的建立。

2.4 Hoechst33258染色

每組細(xì)胞加入 10μg/mL Hoechst33258染液，37℃孵育5min，PBS清洗2次。每組隨機(jī)選取15個(gè)視野，在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)正常肝細(xì)胞核邊界規(guī)則整齊，染色均勻并呈淡染;凋亡肝細(xì)胞核呈現(xiàn)致密濃染，皺縮、碎裂。按細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算新生鼠肝細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)

Annexin V-FITC/PI雙染法:取單細(xì)胞懸液細(xì)胞用1×Binding Buffer調(diào)整至1×106/mL濃度，取100μL細(xì)胞液至5mL流式專(zhuān)用試管，分別加入5μL AV-FITC和10μL PI溶液?；靹蚣?xì)胞，避光孵育15min后，加入400μL的1×Binding Buffer。1h之內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。設(shè)置即未染色的裸細(xì)胞，單染AV-FITC和單染PI。采用488nm激發(fā)光源，首先檢測(cè)對(duì)照管，調(diào)整參數(shù)FSC/SSC，設(shè)定閾值，排除碎片和噪聲的干擾，設(shè)門(mén)(gate)以獲取細(xì)胞，以門(mén)中細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)熒光信號(hào)檢測(cè)。將對(duì)照管(裸細(xì)胞)熒光強(qiáng)度設(shè)定為非特異本底熒光。每個(gè)樣本均獲取10000個(gè)細(xì)胞，數(shù)據(jù)采用CellQuest軟件進(jìn)行分析。流式細(xì)胞儀分析條件:激發(fā)波長(zhǎng)Ex=488 nm;發(fā)射波長(zhǎng)Em=530 nm。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

細(xì)胞熒光染色檢測(cè)數(shù)據(jù) 所有實(shí)驗(yàn)均3次重復(fù)，用SPSS14統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。多組比較用單因素方差分析，均數(shù)間的兩兩比較用t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P＜0.05為有顯著性差異，P＞0.05為無(wú)顯著性差異。

結(jié) 果

1.熒光顯微鏡觀察新生鼠肝細(xì)胞核形態(tài)

正常新生鼠肝細(xì)胞核形態(tài)完整，核膜清晰，染色均勻并呈淡染;新生鼠肝細(xì)胞凋亡后細(xì)胞核碎裂，核膜不清或皺縮或碎裂，染色不均勻并呈致密濃染。從采集各組熒光圖像可以看出:正常培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞(N組)凋亡較少，缺氧刺激后肝細(xì)胞(H組)凋亡數(shù)增加，EGB處理保護(hù)組(B1、B2、B3組)肝細(xì)胞凋亡減少，但不同EGB濃度組間肝細(xì)胞凋亡保護(hù)作用區(qū)別不明顯(圖1)。

2.肝細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡形態(tài)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

熒光顯微鏡下觀察新生鼠肝細(xì)胞核形態(tài)，按凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，每組隨機(jī)選取15個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)分析EGB處理組與缺氧組肝細(xì)胞凋亡率，二者相比有顯著性差異(P ＜0.05)，EGB對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡具有抑制作用，但這種抑制作用未表現(xiàn)出明顯的EGB劑量依賴(lài)性(表1)。

表1 銀杏內(nèi)酯B濃度對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡率的影響()Table 1 Effects of ginkgolide B concentration on the liver cell apoptosis rate()

表1 銀杏內(nèi)酯B濃度對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡率的影響()Table 1 Effects of ginkgolide B concentration on the liver cell apoptosis rate()

*P＜0.05

分組 EGB終濃度視野數(shù)凋亡率(%)對(duì)照組(N組) － 15 2.79±0.33*缺氧對(duì)照組(H組) － 15 33.23±0.44缺氧+銀杏內(nèi)酯B(B1組)1μg/ml 15 18.38±1.15*缺氧+銀杏內(nèi)酯B(B2組)2μg/ml 15 18.47±1.07*缺氧+銀杏內(nèi)酯B(B3組)4μg/ml 15 17.19±0.78*

3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)新生鼠肝細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞儀檢測(cè)缺氧12hEGB保護(hù)組(1μg/ml、2μg/m l、4μg/m l)的 肝細(xì) 胞 早期 凋亡率 分別為19.10%、18.65%、19.80%，單純?nèi)毖踅M細(xì)胞早期凋亡率為34.20%(表2);流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGB保護(hù)下肝細(xì)胞凋亡情況，新生鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)照組早期+晚期凋亡率17.17±2.09%，缺氧組早期+晚期凋亡率85.26±3.42%，缺氧組與對(duì)照組間比較，P＜0.05為有顯著性差異;不同濃度EGB保護(hù)作用下新生鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)12h時(shí)，早期+晚期凋亡率分別為 77.97±4.21%、73.39±2.13%、70.66±4.23%，EGB保護(hù)組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)(表3)。流式結(jié)果與熒光顯微鏡觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果總體一致。

圖1 Hoechst33258染液染色的肝細(xì)胞(200×)。A.正常培養(yǎng)的肝細(xì)胞(N組);B.缺氧誘導(dǎo)凋亡的肝細(xì)胞(H組);C.缺氧+銀杏內(nèi)酯B 1μg/ml(B1組);D.缺氧+銀杏內(nèi)酯B 2μg/ml(B2組);E.缺氧+銀杏內(nèi)酯B 4μg/ml(B3組)Fig.1 Hoechst33258 staining of liver cells(200×).A.Normal culture of liver cells(N組);B.Hypoxia induced apoptosis of liver cells(H 組);C.Hypoxia+EGB1μg/ml(B1 group);D.Hypoxia+EGB2μg/ml(B2 group);E.Hypoxia+EGB4μg/ml(B3 group)

圖2 肝細(xì)胞凋亡流式圖(對(duì)照/N組、缺氧對(duì)照/H組、EGB 1μg/ml/B1組、EGB 2μg/ml/B2組、EGB 4μg/ml/B3組)Fig.2 Apoptosis of liver cell(control group N、Hypoxia control group H、EGB 1μg/ml group B1、EGB 2μg/ml group B2、EGB 4μg/ml group B3)

表2 不同濃度的EGB保護(hù)下細(xì)胞凋亡率(%)Table 2 different concentrations of EGB on cell apoptosis(%)

表3 不同濃度EGB保護(hù)下肝細(xì)胞早期及晚期凋亡情況(%，)Table3 Apoptosis of liver cells at different concentrations of EGB(%，)

表3 不同濃度EGB保護(hù)下肝細(xì)胞早期及晚期凋亡情況(%，)Table3 Apoptosis of liver cells at different concentrations of EGB(%，)

*P＜0.05為有顯著性差異，△P＞0.05為無(wú)顯著性差異。

晚期凋亡對(duì)照組(N組)EGB濃度(μg/ml) 正常細(xì)胞 早期凋亡 晚期凋亡 早期+80.35±4.88*8.49±1.20 8.68±1.02 17.17±2.09*85.26±3.42*1μg/ml(B1組)缺氧組(H組)4.42±2.03*34.21±2.16 50.92±2.85 77.97±4.21*2μg/ml(B2組)4.45±1.85*19.10±2.55△58.87±2.71 73.39±2.13*4μg/ml(B3組)4.27±1.11*18.65±0.09△54.74±3.02 6.74±1.25*19.80±4.52△50.86±0.41 70.66±4.23*

討 論

細(xì)胞凋亡是主動(dòng)性基因控制的自殺過(guò)程，是生物體維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)的生理機(jī)制。肝細(xì)胞凋亡是肝臟的實(shí)質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞死亡的最主要形式，肝細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡失去平衡，肝細(xì)胞發(fā)生再生異常，可能導(dǎo)致慢性肝臟組織病變的發(fā)生［1］。

文獻(xiàn)報(bào)道銀杏內(nèi)酯B具有清除氧自由基、限制多聚不飽和脂肪酶的超氧化、降血脂、抗纖維化、改善微循環(huán)等作用，對(duì)缺血、缺氧等多種因素引起的肝臟損傷有保護(hù)作用［6-8］。同時(shí)，銀杏內(nèi)酯對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元有保護(hù)作用。銀杏葉提取物EGb761有促進(jìn)外周神經(jīng)再生及減少神經(jīng)元凋亡的作用。此外，Daba等［10］的研究表明，GEB可通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化而對(duì)博萊霉素(Bleomycin)誘導(dǎo)的肺纖維化具有防護(hù)作用。在肝臟細(xì)胞方面，研究顯示［9］，GEB對(duì)肝竇狀內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，可以改善慢性肝損傷后微循環(huán)紊亂。

本研究使用不同濃度(1μg、2μg、4μg/ml)銀杏內(nèi)酯B可能是抑制大鼠肝細(xì)胞熒光漂白后熒光恢復(fù)率，解釋了銀杏內(nèi)酯B通過(guò)抑制細(xì)胞間有害物質(zhì)的交換，達(dá)到抑制肝細(xì)胞凋亡及壞死的發(fā)生，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B對(duì)肝細(xì)胞缺氧凋亡有一定的抑制作用，但濃度之間的差異較小，原因可能有:1.缺氧中使部分肝細(xì)胞死亡，非真正凋亡，造成濃度間的差異不明顯;2.注射液選擇的濃度范圍窄而且濃度梯度少，不能明顯的看到反應(yīng)結(jié)果;3.在注射劑中溶劑為聚乙二醇，該物質(zhì)極難溶于水，只有在有機(jī)溶劑中才可溶，實(shí)驗(yàn)中需要用甲醇來(lái)稀釋?zhuān)瑢?duì)細(xì)胞有一定的毒害作用。藥物作用濃度沒(méi)有顯現(xiàn)出來(lái)何種濃度的作用效果最明顯，還需要進(jìn)一步的研究。

綜上，本研究在大鼠肝細(xì)胞胞的體外培養(yǎng)體系中通過(guò)缺氧建立體外凋亡模型，發(fā)現(xiàn)EGB對(duì)肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

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