胥虹貝 羅 勇 朱艷含 李 娟 王盼欣 張 瑩

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

缺血性腦血管病為臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，具有高死亡率、高致殘率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康與生命。腦缺血損傷后，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)可在多種細(xì)胞因子介導(dǎo)下從骨髓動(dòng)員至外周血，并歸巢至腦缺血區(qū)參與血管再生及修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［1-3］。針刺作為中國(guó)傳統(tǒng)的“非藥物”治療手段，對(duì)腦缺血后神經(jīng)、血管再生具有顯著的臨床效應(yīng)［4］。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)/基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix Metallopeptidase 9，MMP-9)是磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase)/蛋白激酶B(protein kinase B)(PI3K/AKT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)下促進(jìn)骨髓EPCs動(dòng)員的關(guān)鍵因素［3，5-6］。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)［7］，電針可上調(diào)大腦缺血皮質(zhì)區(qū) eNOS及MMP-9表達(dá)，但此作用是否與電針促進(jìn)血管再生直接相關(guān)并不明確。故本研究通過(guò)觀察電針及eNOS特異性拮抗劑L-NAME干預(yù)下大腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS、MMP-9表達(dá)變化和CD34+微血管再生情況，以期進(jìn)一步探討電針促進(jìn)局灶腦缺血/再灌注后腦內(nèi)血管再生的機(jī)制。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)成年雄性 SD大鼠120只，體重250～300g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心［SCXK(渝)2012－0002］提供。大鼠隨機(jī)分為正常組(NC組)、模型組(I/R組)、電針組(I/RE組)和電針 +L-NAME組(I/REL組)。根據(jù)局灶腦缺血90min再灌注后觀察的時(shí)間點(diǎn)，將I/R、I/RE和I/REL組各分為再灌注1d、3d和7d三個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)亞組12只。

2.主要試劑盒儀器

eNOS多克隆抗體(Abcam公司，英國(guó))、MMP-9多克隆抗體(Abcam公司，英國(guó))、CD34多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology公司，美國(guó))，L-NAME(上海碧云天生物有限公司，中國(guó))、免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國(guó))、熒光定量PCR相關(guān)試劑(Takara公司，日本)，eNOS引物(上海生物生工有限公司合成)，G6850型電針治療儀(購(gòu)自北京精工儀器廠)。

3.動(dòng)物模型建立與篩選

采用改良線栓法并參照羅勇等［8］介紹的經(jīng)驗(yàn)規(guī)范化制備SD大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)。大鼠術(shù)前禁食一晚，不禁飲。3.5%水合氯醛(1ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠，頸部脫毛后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒后在無(wú)菌條件行頸正中縱行切口，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，分離頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)顱外段，分離 ECA、ICA交通支后結(jié)扎ECA遠(yuǎn)端，沿ICA向下分離翼顎動(dòng)脈，穿線沿起點(diǎn)結(jié)扎，在ECA殘端剪一小口，緩慢插入預(yù)先準(zhǔn)備的頭端圓鈍、直徑約0.25－0.27mm的線栓，線栓經(jīng)CCA分叉處進(jìn)入ICA，線栓頭端距離分叉處約18－20mm處感插線栓有明顯阻力，表示線栓頭端已到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始端，停止繼續(xù)推進(jìn)栓子，固定線栓，清理手術(shù)野，縫合皮膚。栓塞90min后拔出線栓至ECA殘端實(shí)現(xiàn)再灌注。待大鼠完全清醒后，采用Longa 5分法［9］進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分:無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀;1分:輕度局灶神經(jīng)功能缺失(不能完全伸展左側(cè)前肢);2分:中度局灶神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)轉(zhuǎn)圈);3分:重度神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)傾倒);4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。評(píng)分為2－3分者視為造模成功，入選實(shí)驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn):1、神經(jīng)學(xué)癥狀評(píng)分低于2分或等于4分者;2、取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血者;3、腦組織石蠟切片HE染色無(wú)缺血病理改變者;4、未到觀察時(shí)相點(diǎn)死亡者。凡因各種原因?qū)е赂鲗?shí)驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)不足預(yù)定數(shù)量者，均按照隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

4.電針刺激及L-NAME干預(yù)方法

參照中國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸委員會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜，選取大鼠“百會(huì)”穴(GV 20)及左側(cè)“四關(guān)”穴(合谷LI 4/太沖 LR 3)為電針穴位，利用華佗牌不銹鋼銀針(直徑為0.38mm，長(zhǎng)度為1寸)取“百會(huì)”穴斜刺入頭皮1mm，直刺“合谷”穴及“太沖”穴2mm，針刺“百會(huì)”穴及“四關(guān)”穴通電刺激。連接電針治療儀，刺激參數(shù)采用頻率為2/20 Hz，波型為疏密波，強(qiáng)度以大鼠肢體輕微震顫為度。I/RE與I/REL組首次電針刺激于再灌注后1h進(jìn)行，刺激時(shí)間20min/次，每日治療1次，最長(zhǎng)7d。I/REL組大鼠在缺血90min后電針刺激前1h開(kāi)始腹腔注射L-NAME，每次8mg/kg，每日 1 次，最長(zhǎng) 7d，L-NAME終濃度為8mg/mL(每8mg的L-NAME溶于1mL的生理鹽水)［10］。

5.Q-PCR 檢測(cè)

按Takara說(shuō)明書(shū)提取各組大鼠大腦缺血區(qū)皮質(zhì)總RNA，取1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄為20μl cDNA。根據(jù)GenBank提供的基因序列，擴(kuò)增大鼠eNOSmRNA的上游引物為5'-GCAGAGGAGTCCAGCGAACA-3'，下游引物為 5'-GAAATTGTTCCAGCACCTCTAGC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度115bp。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃ 30s，PCR 反應(yīng)95℃ 5s、60℃ 30s，40 個(gè)循環(huán)。

6.免疫組織化學(xué)染色

將切片脫蠟至水，微波修復(fù)26min(高火3min，低火3min，低火與解凍之間20min)，自然冷卻至室溫，3%H2O2室溫孵育30min，加動(dòng)物血清37℃封閉30min，加一抗(eNOS、MMP-9和CD34一抗稀釋比例分別為1∶100、1∶100 和1∶50)，同時(shí)滴加PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，4℃過(guò)夜;第2d 37℃孵育1.5h，加二抗37℃孵育30min，加鏈霉素標(biāo)記卵蛋白，室溫孵育20min，DAB顯色，蘇木素染核、脫色、返藍(lán)、酒精脫水、透明、封片。

7.結(jié)果判定

所有切片均標(biāo)號(hào)，取非連續(xù)的3張切片，每張切片讀取非連續(xù)的5個(gè)視野取值。eNOS及MMP-9蛋白半定量分析:在400倍視野下，采用Image-Pro Plus 16.0圖像測(cè)量分析軟件自動(dòng)測(cè)定觀察區(qū)胞漿染為黃色或棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值(Mean Optical Density，MOD)，即為eNOS及MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果。缺血區(qū)微血管密度(Microvessel Density，MVD)結(jié)果判定:根據(jù)Weidner等［11］改良血管計(jì)數(shù)法，在200倍視野下觀察，CD34表達(dá)以血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)有淺棕色至深棕色顆粒沉著為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)CD34+微血管密度(血管直徑＜20μm或單個(gè)細(xì)胞陽(yáng)性但和周?chē)?xì)胞分界清楚視為一個(gè)新生血管)，微血管數(shù)(個(gè)/HP)為每個(gè)視野下的血管數(shù)。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1.電針及L-NAME干預(yù)對(duì)局灶腦缺血/再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOS蛋白免疫反應(yīng)性的影響

免疫組化結(jié)果顯示，NC組大鼠右側(cè)大腦皮質(zhì)eNOS表達(dá)很少。I/R和I/RE組再灌注后各時(shí)間點(diǎn)eNOS表達(dá)均顯著高于NC組(P＜0.01)，I/RE組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)較I/R組增多(P＜0.05)。在eNOS特異性拮抗劑L-NAME作用下，I/REL組再灌注后各時(shí)間點(diǎn)eNOS表達(dá)均低于I/RE組(P＜0.05)(圖1)

2.電針及L-NAME干預(yù)對(duì)局灶腦缺血/再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)eNOSm RNA表達(dá)的影響

Q-PCR結(jié)果顯示，eNOS mRNA表達(dá)規(guī)律與eNOS蛋白表達(dá)一致。I/RE組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均明顯高于I/R組(P＜0.05)。eNOS作用被阻斷后，I/REL組eNOS mRNA表達(dá)顯著低于I/RE組(P＞0.05)。

3.電針及L-NAME干預(yù)對(duì)局灶腦缺血/再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)MMP-9蛋白免疫反應(yīng)性的影響

免疫組化結(jié)果顯示，NC組大腦皮質(zhì)MMP-9表達(dá)很少。I/R組MMP-9表達(dá)于再灌注后1d開(kāi)始增加(P＜0.05)，3d時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.05)，7d時(shí)開(kāi)始下降(P＜0.05)。再灌注后1d、3d，I/RE組MMP-9表達(dá)較I/R組明顯降低(P＜0.05)，7d時(shí)I/RE組顯著多于I/R組(P＜0.05)。在L-NAME作用下，I/REL組再灌注后1、3d，MMP-9表達(dá)較I/RE組增多(P＜0.05)，7d時(shí)明顯低于I/RE組(P＜0.05)。與I/R比較，I/REL組表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(圖3)。

4.電針及 L-NAME干預(yù)對(duì)局灶腦缺血/再灌注大鼠大腦缺血皮質(zhì)區(qū)CD34+微血管密度(MVD)的影響

免疫組化結(jié)果顯示，1d新生血管以單個(gè)細(xì)胞為主，管徑較小;7d新生血管密度增多，不同管徑血管并存。與I/R組比較，I/RE組各時(shí)間點(diǎn)CD34+微血管密度均顯著增多(P＜0.05)，在L-NAME作用下，I/REL組各時(shí)間點(diǎn)微血管數(shù)目均明顯低于I/RE組(P＜0.05)(圖4)。

圖1 免疫組化顯示各組不同時(shí)間點(diǎn)eNOS蛋白表達(dá)變化(400×)A1，A3，A7:I/R 1d，I/R 3d，I/R 7d;B1，B3，B7:I/RE 1d，I/RE 3d，I/RE 7d;C1，C3，C7:I/REL 1d，I/REL 3d，I/REL 7d;D:NC;*:P ＜0.01 與 NC 組比較;#:P ＜0.05 與I/R和I/REL組比較Fig.1 Changes of the expression of eNOS in each group detected by immunohistochemistry at different time points(400 × )A1，A3，A7:I/R 1d，I/R 3d，I/R 7d;B1，B3，B7:I/RE 1d，I/RE 3d，I/RE 7d;C1，C3，C7:I/REL 1d，I/REL 3d，I/REL 7d;D:NC;*:P ＜0.01，compared with NC group;#:P ＜0.05;comapred with I/R and I/REL groups

圖2 Q-PCR顯示各組不同時(shí)間點(diǎn)MMP-9蛋白表達(dá)變化 *:P＜0.01與NC組比較;#:P＜0.05與I/R和I/REL組比較Fig.2 Changes of the expression of eNOS in each group detected by Q-PCR at different time points *:P ＜0.01，compared with NC group;#:P＜0.05;compared with I/R and I/REL groups

圖3 免疫組化顯示各組不同時(shí)間點(diǎn)MMP-9表達(dá)變化(400×)A-D:NC，I/R 7d，I/RE 7d，I/REL 7d;*:P＜0.05與NC組比較;#:P＜0.05與I/R和I/REL組比較Fig.3 Changes of the expression of MMP-9 in each group detected by immunohistochemistry at different time points(400 × )AD:NC，I/R 7d，I/RE 7d，I/REL 7d;*:P ＜0.05，compared with NC group;#:P ＜0.05;comapred with I/R and I/REL groups

圖4 免疫組化顯示各組不同時(shí)間點(diǎn)CD34+微血管密度變化 A:NC;B:I/R 7d;C:I/RE 7d;D:I/REL 7d(200×);A1:NC;B1:I/R 7d;C1:I/RE 7d;D1:I/REL 7d(400×);*:P＜0.05，與NC組比較;#:P＜0.05，與I/RE和I/REL組比較Fig.4 Changes of number ofCD34+microvessels in each group detected by immunohistochemistry at different time points.A:NCgroup;B:I/R group 7d;C:I/RE group 7d;D:I/REL group 7d(×200);A1:NC;B1:I/R 7d;C1:I/RE 7d;D1:I/REL 7d(400×);*:P＜0.05，compared with NC group;#:P ＜0.05，compared with I/RE and I/REL groups

討 論

穴位針刺用于治療缺血性腦血管病已有數(shù)千年歷史，并已得到廣泛應(yīng)用和認(rèn)可。研究表明，“百會(huì)”穴與“四關(guān)”穴的配伍能夠達(dá)到醒腦開(kāi)竅、舒經(jīng)活絡(luò)、祛痰化瘀的作用，是治療腦卒中最常選取的基礎(chǔ)穴。EPCs作為一群具有游走性，能進(jìn)一步增殖并定向分化的幼稚內(nèi)皮細(xì)胞［12］，主要存在于機(jī)體骨髓［13］。腦缺血發(fā)生后，損傷組織釋放HIF-1(缺氧誘導(dǎo)因子)可誘導(dǎo) VEGF、SDF-1、Ang-1、Tie-2等細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)骨髓EPCs動(dòng)員至外周血，進(jìn)而分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行循環(huán)、增殖，參與腦缺血區(qū)血管再生。Iskander等［14］通過(guò) MRI證實(shí)，經(jīng)靜脈給予MCAO模型大鼠臍帶血來(lái)源的EPCs可定向遷移至腦梗死灶周?chē)瑴p少梗死面積，促進(jìn)神經(jīng)及血管再生。移植人體晚期的EPCs可增加卒中后大腦皮質(zhì)局部血流量，減少細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)功能缺損［15］。EPCs在增殖分化過(guò)程中，細(xì)胞表面標(biāo)記呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)組合的變化，研究發(fā)現(xiàn)，電針可上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血VEGFR2+EPCs、VEGFR2+PECAM-1+EPCs、VEGFR2+CD31+EPCs 數(shù)量，促進(jìn)骨髓EPCs動(dòng)員至外周血［16-18］。關(guān)于電針通過(guò)何種途徑促進(jìn)骨髓EPCs動(dòng)員至外周血，參與腦缺血后腦內(nèi)血管再生，是目前的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

研究表明，eNOS/MMP-9在促進(jìn)骨髓EPCs動(dòng)員及缺血后腦內(nèi)血管再生方面發(fā)揮重要作用。腦缺血發(fā)生后，腦內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)途徑被激活，活化的AKT可誘導(dǎo)eNOS磷酸化，增加一氧化氮(NO)合成，NO促進(jìn)MMP-9硝基化，活化的MMP-9促使膜結(jié)合性Kit配體(mKitL)轉(zhuǎn)化為可溶性配體(sKitL)，使EPCs易于脫離骨髓微環(huán)境參與缺血區(qū)血管生成［19-20］。Aicher 等［21］研 究 發(fā) 現(xiàn) 缺 乏 eNOS 的Nos3(－/－)小鼠骨髓中 MMP-9明顯減少，由 mKitL轉(zhuǎn)化而來(lái)的sKitL相應(yīng)減少，從而使依賴(lài)eNOS/MMP-9的干/祖細(xì)胞動(dòng)員明顯減弱;而在重新注入sKitL后，動(dòng)員作用恢復(fù)，eNOS激活為MMP-9活化，并促使基底膜降解，促進(jìn)骨髓微環(huán)境中EPCs動(dòng)員至外周血。Cui等［22］發(fā)現(xiàn)eNOS可以促進(jìn)腦梗死后的血管再生，敲除eNOS基因的小鼠較野生型小鼠腦梗死后死亡率高，神經(jīng)功能缺損癥狀更為明顯，在使用NO供體DETA-NONOate后明顯改善。提示eNOS/MMP-9在促進(jìn)EPCs動(dòng)員及腦內(nèi)血管再生中具有重要作用。歸巢至缺血區(qū)的EPCs可參與缺血組織的血管重建和損傷血管的再內(nèi)皮化過(guò)程，由于成熟血管內(nèi)皮表達(dá)的CD34主要存在于毛細(xì)血管網(wǎng)，大血管內(nèi)皮不表達(dá)CD34［23］，因此采用CD34作為標(biāo)記計(jì)數(shù)新生血管密度，具有較強(qiáng)的特異性、敏感性和可重復(fù)性［24］，故本研究采用CD34標(biāo)記新生微血管。由于目前關(guān)于eNOS/MMP-9在電針促進(jìn)腦缺血后血管再生中的作用探討未見(jiàn)采用eNOS特異性拮抗劑L-NAME阻斷eNOS作用，并進(jìn)一步研究腦內(nèi)微血管再生情況。本研究旨在采用藥物干預(yù)，直接證實(shí)電針通過(guò)eNOS/MMP-9對(duì)血管再生的作用。既往研究表明［10］，采用腹腔注射L-NAME，計(jì)量為8mg/kg能達(dá)到最好的阻斷eNOS效果，故本研究采用上述干預(yù)手段阻斷eNOS作用。本研究結(jié)果表明，電針組eNOSmRNA及蛋白表達(dá)隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)呈進(jìn)行性遞增趨勢(shì)，再灌注后1d、3d，電針組MMP-9表達(dá)顯著降低，CD34+微血管密度明顯升高，神經(jīng)功能缺損癥狀得到明顯改善，而腹腔注射L-NAME后，電針對(duì)腦缺血的保護(hù)作用明顯受到抑制，表明在缺血早期，電針可通過(guò)上調(diào)eNOS表達(dá)、抑制內(nèi)源性MMP-9合成和分泌，促進(jìn)缺血區(qū)血管再生。既往研究表明，腦梗塞24h時(shí)在缺血區(qū)及其周邊的內(nèi)皮細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到MMP-9，MMP-9可通過(guò)蛋白水解作用破壞毛細(xì)血管壁緊密連接和基底膜，繼而引起血管源性水腫［25-26］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，推測(cè)電針在缺血早期抑制MMP-9的表達(dá)促進(jìn)微血管再生與電針抑制MMP-9在缺血早期介導(dǎo)的二次損傷有關(guān)。而再灌注后7d，電針組MMP-9表達(dá)較模型組顯著升高，CD34+微血管密度持續(xù)增多，神經(jīng)功能進(jìn)一步改善，在L-NAME特異性阻斷eNOS作用后，電針促M(fèi)MP-9表達(dá)的作用明顯受到抑制，與此同時(shí)，新生微血管數(shù)目減少更為顯著。結(jié)合本團(tuán)隊(duì)前期研究［27］，我們推測(cè):電針可促進(jìn)缺血后骨髓 CD34+EPCs持續(xù)動(dòng)員至外周血，在缺血后期電針可持續(xù)上調(diào)eNOS表達(dá)并介導(dǎo)MMP-9表達(dá)升高，而激活的MMP-9可能主要發(fā)揮清除基質(zhì)細(xì)胞上粘附的結(jié)合作用［20］，使得EPCs通過(guò)跨內(nèi)皮遷移離開(kāi)骨髓參與血管再生，但其內(nèi)在機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，有待我們進(jìn)一步的深入研究。

本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，采用腹腔注射LNAME特異性阻斷eNOS作用，同時(shí)研究不同組別及對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腦內(nèi)血管再生情況。發(fā)現(xiàn)電針上調(diào)缺血皮質(zhì)區(qū) eNOS，早期下調(diào) MMP-9表達(dá)、晚期上調(diào)MMP-9表達(dá)以及促進(jìn)缺血區(qū)血管再生的作用被減弱，直接證實(shí)了電針可通過(guò)eNOS/MMP-9發(fā)揮腦缺血后腦內(nèi)保護(hù)作用，并進(jìn)一步證明了電針可能通過(guò)eNOS/MMP-9介導(dǎo)骨髓EPCs動(dòng)員歸巢至缺血區(qū)參與血管再生，為電針在臨床上治療腦梗死中提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

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