柴繼俠 張艷萍 尹海燕 李徽徽 周艷梅 賀文欣 王元元 張志誠(chéng)

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院組胚教研室，蚌埠 233030;2山東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，濟(jì)南 250000;3蚌埠醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，蚌埠 233030)

先天性腭裂畸形是由遺傳和環(huán)境因素共同作用 導(dǎo)致的多基因遺傳病，但其具體發(fā)病機(jī)制至今仍未完全闡明。在先天性腭裂畸形的發(fā)病機(jī)制研究中，穩(wěn)定的腭裂動(dòng)物模型對(duì)研究人類腭裂的發(fā)病原因、演變機(jī)制及預(yù)防具有重要意義［1］。由于小鼠腭的正常發(fā)育及腭裂形成與人類十分相似，且繁殖周期短，產(chǎn)仔多，因此國(guó)內(nèi)外多使用小鼠來(lái)制備腭裂畸形動(dòng)物模型。

四氯二苯并二惡英 (tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是一類持久性環(huán)境有機(jī)污染物，由于其高毒性、難降解、強(qiáng)脂溶性，容易在食物鏈中產(chǎn)生蓄積作用，對(duì)人類健康和環(huán)境安全構(gòu)成極大威脅，可來(lái)源于汽車尾氣、垃圾焚燒、農(nóng)藥及劑等，易通過(guò)食物鏈及環(huán)境污染物進(jìn)入生物體內(nèi)蓄積，危及人體健康［2］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn) TCDD與腭裂畸形發(fā)生密切相關(guān)［3，4］。

昆明小鼠是我國(guó)生產(chǎn)量、使用量最大的遠(yuǎn)交系小鼠。通過(guò)TCDD誘導(dǎo)產(chǎn)生昆明小鼠腭裂動(dòng)物模型，尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文采用不同劑量的 TCDD灌胃不同妊娠天數(shù)(gestational day，GD)的昆明小鼠，通過(guò)計(jì)數(shù)胎鼠腭裂發(fā)生率、觀測(cè)胎鼠腭解剖結(jié)構(gòu)及組織結(jié)構(gòu)，建立一種穩(wěn)定高效的昆明小鼠腭裂畸形動(dòng)物模型。

材料和方法

1.材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年未經(jīng)產(chǎn)昆明小鼠，周齡8－10周，體重25－30克，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑

TCDD購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，用超市出售的優(yōu)質(zhì)花生油配制成4μg/ml的濃度，HE試劑盒購(gòu)自碧云天試劑公司。

2.方法

2.1 小鼠飼養(yǎng)

60只昆明小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，顆粒喂食，自來(lái)水隨意飲水，明暗周期各12小時(shí)，室溫20－22℃。下午6點(diǎn)小鼠按雌雄3:1合籠，次日上午8時(shí)查陰栓，陰栓陽(yáng)性者記錄為孕 0天 (gestational day，GD0)。將孕鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組40只，對(duì)照組20只。

2.2 致畸方法

實(shí)驗(yàn)組分為5個(gè)小組。其中3個(gè)小組分別于GD11.5、GD12.5和 GD13.5，一次性灌服20μg/kg的TCDD溶液。另外2個(gè)小組分別于GD12.5一次性灌服10μg/kg和40μg/kg的 TCDD溶液。對(duì)照組一次性灌服等劑量花生油。

2.3 毒性、致畸性檢測(cè)

記錄GD16.5時(shí)各組孕鼠一般情況和胎鼠存活情況，解剖鏡下觀察胎鼠有無(wú)腭裂和其他畸形，統(tǒng)計(jì)腭裂發(fā)生率。

2.4 組織學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組分別于 GD13.5、GD14.5、GD15.5和GD16.5剖腹取胎，部分胚胎用4% 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片、HE染色，觀察各組胎鼠腭裂組織學(xué)特征。同時(shí)取 GD14.5、GD16.5時(shí)孕鼠及胎鼠的肝、肺器官，常規(guī)石蠟切片HE染色，光鏡下觀察各臟器的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，腭裂發(fā)生率的比較用 x2檢驗(yàn)和確切概率法。Peason線性相關(guān)分析TCDD劑量和腭裂發(fā)生率的相關(guān)性，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.給藥方案的確定

GD11.5、GD12.5和 GD13.5一次性灌服20μg/kg的 TCDD溶液，腭裂發(fā)生率為(23/33)69.7%、(36/44)81.82% 和(12/34)35.29%。GD11.5和GD12.5兩組之間腭裂發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，雖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但GD11.5組腭裂之間的距離較小，腭裂沒(méi)有GD12.5組明顯。GD12.5和GD13.5兩組之間腭裂發(fā)生率呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(表1)。故選取GD12.5作為最佳用藥時(shí)間。

表1 妊娠不同天數(shù)給予20μg/kg TCDD灌胃后胎鼠腭裂發(fā)生率Table 1 The incidence of fetalm ice cleft palate after given 20μg/kg TCDD lavage at different gestational day

GD12.5給予0、10、20和40μg/kg的TCDD溶液灌胃后，胎鼠腭裂發(fā)生率為(2/51)3.92%、(20/43)46.51%、(36/44)81.82% 和(50/51)98.04%。和對(duì)照組相比，TCDD實(shí)驗(yàn)組腭裂發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)(表 2)。和 20μg/kg組相比，10μg/kg和40μg/kg組腭裂發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。Peason線性相關(guān)分析顯示，TCDD劑量與腭裂發(fā)生率之間呈正相關(guān)(r=0.895，P ＜0.01)(圖1)。

各組孕鼠一般情況良好，無(wú)明顯的中毒、流產(chǎn)現(xiàn)象。胎鼠未見(jiàn)眼部、尾部、四肢和皮膚等畸形。GD12.5給予40μg/kg的TCDD組有1只死胎，其余均為活胎。

故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用最佳的造模條件GD12.5灌胃40μg/kg TCDD為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組則給予等劑量玉米油。

表2 GD12.5給予不同劑量TCDD灌胃后胎鼠腭裂發(fā)生率Table 2 The incidence of fetalm ice cleft palate after given different dose TCDD by lavage on GD12.5

圖1 TCDD劑量與腭裂發(fā)生率的相關(guān)性Fig.1 The correlation between TCDD dose andthe cleft palate incidence

2.解剖鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組腭裂畸形形成

GD13.5時(shí)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組胎鼠的側(cè)腭突位于舌兩側(cè)。GD14.5時(shí)，對(duì)照組胎鼠側(cè)腭突增大并呈對(duì)向生長(zhǎng)，側(cè)腭突頭端開(kāi)始融合;實(shí)驗(yàn)組側(cè)腭突增大，但未出現(xiàn)融合。GD15.5和GD16.5時(shí)，對(duì)照組兩側(cè)腭突完全融合，形成完整的腭，GD16.5時(shí)腭的骨化明顯;實(shí)驗(yàn)組側(cè)腭突體積繼續(xù)增大，GD15.5時(shí)兩側(cè)腭突之間的距離相對(duì)縮小，但未出現(xiàn)接觸融合，GD16.5時(shí)，側(cè)腭突之間的距離增大，頭端部分出現(xiàn)骨化，并形成腭裂畸形(圖2)。

3.光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)組腭裂畸形形成

GD13.5時(shí)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組胎鼠的側(cè)腭突位于舌兩側(cè)。GD14.5時(shí)，對(duì)照組胎鼠側(cè)腭突上抬至舌上方，呈對(duì)向生長(zhǎng);實(shí)驗(yàn)組側(cè)腭突體積增大，但未上抬，仍位于舌兩側(cè)。GD15.5和GD16.5時(shí)，對(duì)照組兩側(cè)腭突完全融合，融合處上皮縫消失，出現(xiàn)一個(gè)富含細(xì)胞的團(tuán)狀區(qū)域;實(shí)驗(yàn)組兩側(cè)腭突上抬至舌的上方，呈對(duì)向生長(zhǎng)，但兩者之間距離大，未出現(xiàn)接觸融合，形成腭裂畸形(圖3)。

圖2 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組于 GD13.5～16.5時(shí)腭發(fā)育的解剖鏡觀察(Bar=80μm)Fig.2 The palatal development of the fetalmiceduring GD13.5 to GD16.5 in two groups by anatomical lens(Bar=80μm)

圖3 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組于GD13.5～16.5時(shí)腭組織的HE染色 (Bar=400μm)Fig.3 The palate developmentof the fetalmice during GD13.5 to GD16.5 in two groups by HE staining(Bar=400μm)

4.實(shí)驗(yàn)組孕鼠及胎鼠肝、肺的組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常

GD14.5時(shí)，實(shí)驗(yàn)組孕鼠肝組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比，肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，但肝細(xì)胞索排列仍比較規(guī)則;GD16.5時(shí)，兩組肝細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯異常。孕鼠肺及胎鼠的肝、肺組織結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯異常(圖4)。

圖4 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組于GD14.5及GD16.5時(shí)，孕鼠、胎鼠的肝、肺組織HE染色(Bar=100μm)Fig.4 The organizational structure of liver and lung in pregnantmice and fetalmice on GD14.5 and GD16.5 in two groups by HE staining(Bar=100μm)

討 論

TCDD是二惡英中毒性最強(qiáng)的一種環(huán)境污染物，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、半衰期長(zhǎng)，具有脂溶性，易通過(guò)食物鏈及環(huán)境污染物進(jìn)入生物體內(nèi)蓄積，危及人體健康，尤其是干擾正常的胚胎發(fā)育［2］。近幾年越來(lái)越多的文獻(xiàn)采用 TCDD［5，6］或聯(lián)合使用糖皮質(zhì)激素類［7］誘導(dǎo)腭裂發(fā)生，此外還有維甲酸類［8］、甲基 N-硝基亞硝基胍 (MNNG)［1］等或聯(lián)合使用［9］。這些先天性腭裂畸形動(dòng)物模型，主要用于腭裂病因?qū)W和發(fā)生機(jī)制方面的研究。

對(duì)不同致畸物質(zhì)或不同動(dòng)物而言，腭裂畸形的發(fā)生條件不同，可能與致畸物質(zhì)不同的作用機(jī)制或種屬差異性、敏感性等有關(guān)。何曉夢(mèng)等［3］研究顯示，GD10給予28μg/kg TCDD，是 C57BL/6J胎鼠腭裂模型建立的最適劑量，腭裂的發(fā)生率為93.02%。對(duì)ICR小鼠而言，GD10給予40 mg/kg MNNG，是該種腭裂畸形發(fā)生的最佳條件，但是腭裂的畸形率為55.2%［10］。全反式維A酸作用于昆明小鼠，理想腭裂動(dòng)物模型的條件是GD10給予80 mg/kg劑量，腭裂的發(fā)生率為100%。絕大多數(shù)兩側(cè)腭突不能上抬至正常水平并向水平方向生長(zhǎng)，極少部分發(fā)現(xiàn)有單側(cè)腭突上抬，腭突發(fā)育不全，體積較小，不能在中線相互接觸融合形成腭板［8］。本文研究顯示，對(duì)昆明小鼠而言，TCDD的最佳使用時(shí)間在 GD12.5，最佳使用劑量是40μg/kg，腭裂的發(fā)生率為98.04%。和其他模型相比，本文的模型成功率高，腭裂形成的具體過(guò)程和類型穩(wěn)定一致，對(duì)孕鼠和胎鼠其他臟器的毒性作用非常小。

腭器官發(fā)育是一個(gè)連續(xù)、復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，包括腭突的垂直生長(zhǎng)、上抬、接觸及融合等關(guān)鍵步驟［3］。本研究對(duì)照組顯示，側(cè)腭突的發(fā)育也經(jīng)歷了垂直生長(zhǎng)期(GD13.5)，上抬接觸期(GD14.5)和腭突融合期(GD15.5和 GD16.5)。和尹海燕等［8］等的結(jié)果相似。本研究實(shí)驗(yàn)組結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，側(cè)腭突上抬延遲1天左右(GD14.5時(shí)仍位于舌兩側(cè);GD15.5時(shí)，側(cè)腭突上抬至舌的上方)，側(cè)腭突始終沒(méi)有接觸和融合(GD16.5時(shí)側(cè)腭突之間的距離更大)，形成腭裂畸形。因此本研究表明，TCDD主要通過(guò)延遲側(cè)腭突上抬誘導(dǎo)昆明小鼠腭裂畸形發(fā)生，與何曉夢(mèng)等使用近交系小鼠的文獻(xiàn)［3］報(bào)道相似。然而有文獻(xiàn)報(bào)道TCDD主要通過(guò)干擾腭中嵴上皮分化、影響兩側(cè)腭突融合以誘導(dǎo)小鼠腭裂畸形發(fā)生［11，12］，出現(xiàn)這種不一致可能是由于所使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳基因背景不同導(dǎo)致。腭裂的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜多樣，不同致畸物質(zhì)、不同動(dòng)物模型具體發(fā)生機(jī)制的研究將為腭裂機(jī)制的研究提供更廣的空間和思路。

本研究顯示，實(shí)驗(yàn)組孕鼠肝臟在 GD14.5時(shí)肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，可能是由于肝細(xì)胞對(duì) TCDD進(jìn)行解毒處理，發(fā)生脂肪樣變的緣故。在 GD 16.5時(shí)，肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，說(shuō)明孕鼠的肝細(xì)胞對(duì)該劑量的 TCDD可以代謝，不會(huì)造成肝細(xì)胞或肝組織結(jié)構(gòu)的明顯破壞。孕鼠一般情況良好，孕鼠肺、胎鼠肺以及胎鼠肝組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常，提示該劑量的TCDD沒(méi)有明顯的母體中毒癥狀。此外該劑量的 TCDD對(duì)胎鼠的發(fā)育毒性有明顯組織性特異性，跟以往報(bào)道一致［11，13］。

昆明小鼠是我國(guó)生產(chǎn)量、使用量最大的遠(yuǎn)交系小鼠，抗病力強(qiáng)、繁殖快且價(jià)格低廉。本研究給予GD12.5昆明孕鼠一次性灌胃40μg/kg TCDD，成功地建立穩(wěn)定、高效的昆明小鼠腭裂畸形動(dòng)物模型，腭裂發(fā)生率高達(dá)98.04%，TCDD主要通過(guò)延遲側(cè)腭突上抬誘導(dǎo)昆明小鼠腭裂的發(fā)生。這將為科研工作者對(duì)腭裂畸形發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制等的研究提供穩(wěn)定高效的昆明小鼠腭裂模型。

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