楊志華 宋 憶 楚廣品 邱 平 彭文鵬 孟憲芳*

(1華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院神經生物學系，武漢 430030;2華中科技大學同濟醫(yī)學院協(xié)和醫(yī)院西區(qū)心內科，武漢 430030)

葡萄糖的新陳代謝紊亂會導致神經細胞的一系列病變，血糖在體內外的神經功能方面有重要作用，血糖代謝的紊亂和多種神經系統(tǒng)疾病有關［1］。研究表明，糖尿病能引起認知功能障礙［2］。與非糖尿病人相比，糖尿病患者患有認知功能障礙有更大的概率更大的風險［3］。紅景天苷(Salidroside，Sal)是紅景天的一個酚類糖苷，紅景天生長在高山上，在中國很久以前就一直用來抗疲勞。有研究表明，Sal具有神經保護的作用，并且可以改善糖尿病腦病模型大鼠學習記憶能力［4-5］。然而，Sal神經保護的作機制尚未完全闡明。本文擬探討Sal對高糖刺激體外培養(yǎng)神經元的影響，以及其神經保護機制，為治療糖尿病腦病提供一定的理論基礎。

材料和方法

1.材料

Cleaved caspase-3和BDNF抗體購自于Cell signaling Technology;NeuN購自于Millipore公司;驢抗鼠熒光二抗購自武漢艾美捷生物技術有限公司;胰酶和多聚賴氨酸(MW大于300000)購于Sigma公司。BDNF ELASA試劑盒購自于達科為生物技術有限公司。紅景天苷購自于上海同田生物技術有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)基和B27均購自于Gibco公司。

2.方法

2.1 神經元原代培養(yǎng)

參考原代神經元培養(yǎng)的方法［6］，所有步驟均在無菌條件下進行。健康SD孕鼠，孕期17到19天，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供。頸椎脫臼處死孕鼠，剖腹取出胎鼠，斷頭置于D-Hanks溶液中，分離皮質，去除腦膜，剪碎組織，用0.125%的胰酶37℃細胞培養(yǎng)箱中消化5分鐘，用10%的胎牛血清終止消化，并吹打至無大的組織碎塊，200目篩網過濾并回收濾液到離心管中，800r/min離心5min，用DMEM高糖培養(yǎng)基將沉淀吹打重懸，細胞分別種于6cm細胞培養(yǎng)皿中，每孔2×106個細胞。24孔板中每孔5×105個細胞(培養(yǎng)皿事先用多聚賴氨酸處理過)，4小時后用Neurobasal培養(yǎng)基全換液，之后每隔三天半量換液。

2.2 神經元鑒定

體外原代培養(yǎng)6～8天的皮質神經元，從孔板內取出蓋玻片用PBS沖洗(5 min×3次)，4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗，0.2%TritonX-100破膜20 min，PBS沖洗，5%BSA室溫封閉30 min后，加入鼠抗NeuN單克隆抗體(1∶50)于濕盒內，4℃冰箱過夜，次日將標本置于37℃復溫l h，然后以PBS沖洗3次，加入驢抗鼠FITC熒光二抗(1∶300)進行標記。Hochest復染核后于熒光顯微鏡下觀察、拍照。陰性對照除一抗以PBS替代NeuN外，其余步驟相同。NeuN定位于細胞核內，核中出現(xiàn)綠色熒光為陽性結果，陰性對照細胞內不出現(xiàn)綠色熒光。高倍鏡下隨機抽取5個視野內全部細胞及陽性細胞計數(shù)，取其均值。神經元細胞純度%=(NeuN陽性細胞數(shù)/Hochest陽性細胞數(shù))×100%。

2.3 細胞處理

皮質神經元生長6天時，細胞隨機分為對照組，高糖組，Sal組(Sal終濃度分別為50和100μM)，Sal組在加入藥物1h后，高糖組和Sal組分別加入高糖，使高糖終濃度為50mM。37℃繼續(xù)培養(yǎng)細胞，24h后收細胞的上清、蛋白和爬片。

2.4 Western blot檢測細胞cleaved caspase-3和BDNF的蛋白表達

Western blot的詳細方法如文獻所述［6］，用PBS清洗三遍細胞，最后一次將PBS吸棄干凈，加入RIPA 裂解液，12000r/min，4℃離心 15min，上清液即為總蛋白。每孔加入等量的蛋白樣品，用十二烷基硫酸鈉-丙烯酰胺凝膠恒壓電泳后，轉印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，與1∶1000稀釋的一抗4℃孵育過夜，用TBST漂洗后，室溫孵育二抗(1:2000稀釋)1h，漂洗后用ECL液發(fā)光，X線膠片顯影，最后用Image J軟件分析結果。

2.5 ELISA試劑盒檢測上清中BDNF的含量

取培養(yǎng)細胞上清，4℃，1000r/min，離心 5min，取離心后的上清液，按照ELISA試劑盒說明檢測BDNF的含量。

2.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤標示，應用SPSS13.0軟件作數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，行單因素方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.大鼠皮層神經元原代培養(yǎng)及鑒定

神經元在培養(yǎng)第6天分化成熟，可見細胞散在生長，胞體小，折光性強，形成密集的神經細胞網絡。培養(yǎng)第6天，運用神經元特異性標志物NeuN抗體利用免疫熒光方法標記神經元。結果發(fā)現(xiàn)，NeuN陽性細胞占全部細胞的百分比的為90.12±1.25%，見圖1。

圖1 大鼠皮層神經元鑒定Fig.1 The identification of cortical neurons of rat

2.Sal對高糖處理神經元cleaved caspase 3表達的影響

Western Blot結果顯示，在相對分子量為17 kDa處有一清晰的cleaved caspase 3蛋白條帶，以43 kDa β-actin為內參采用灰度值半定量法進行統(tǒng)計學分析，結果顯示，50 mM高糖刺激體外培養(yǎng)的皮質神經元，可顯著誘導cleaved caspase 3表達，與對照組相比，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而50和100μM Sal處理組，可顯著降低高糖誘導的cleaved caspase 3的表達，與高糖處理組相比，差異顯著(P＜0.05)(圖2)。

圖2 Sal對高糖處理神經元中cleaved caspase 3表達的影響Fig.2 Effects of Sal on the expression of cleaved caspase 3 in high glucose-treated neuronsCtrl:control;Vehl:Vehicle;Sal:Salidroside;*P＜0.05vs Ctrl;#P＜0.05 vs vehl

3.Sal對高糖處理神經元中BDNF表達的影響

圖3 結果顯示，與對照組相比，高糖處理組神經元中BDNF的表達未見明顯變化，50μM Sal亦未導致BDNF表達的改變。但100μM Sal可以顯著增加神經元中BDNF的表達。

圖3 Sal對高糖處理神經元中BDNF表達的影響Fig.3 Effects of Sal on the expression of BDNF in high glucose-treated neurons.Ctrl:control;Vehl:Vehicle;Sal:Salidroside;*P ＜ 0.05 vs Ctrl

4.Sal對神經元培養(yǎng)液中BDNF含量的影響

與對照組相比，高糖處理組神經元培養(yǎng)液中BDNF的含量明顯降低(P＜0.05)。與高糖處理組相比，50μM Sal組培養(yǎng)液中的BDNF含量呈增高趨勢，但差異無顯著性;但100μM Sal組中培養(yǎng)液中BDNF的含量明顯增加，差異顯著(P＜0.05)(圖4)。

圖4 Sal對神經元培養(yǎng)液中BDNF含量的影響Fig.4 Effects of Sal on the content of BDNF in cultured medium.Ctrl:control;Vehl:Vehicle;Sal:Salidroside;*P＜0.05 vs Ctrl;#P＜0.05 vs Vehl

討 論

糖尿病是嚴重危害人類健康的常見病。最新數(shù)據(jù)顯示，我國患糖尿病人數(shù)達1億人，其多種急慢性并發(fā)癥是患者致死和致殘的重要原因。糖尿病不僅影響周圍神經［7］，其亦可累及中樞神經系統(tǒng)，影響多種蛋白的表達，使大腦在結構、神經生理及神經精神等方面發(fā)生病理改變，導致患者學習和記憶能力的降低。輕者出現(xiàn)認知功能障礙，嚴重者出現(xiàn)癡呆，影響老年患者的生活質量［8］。這種由糖尿病引起的認知障礙和大腦的神經生理及結構改變，稱為糖尿病腦病。

盡管自1965年Nielsen就提出“糖尿病腦病”的概念［9］，但目前糖尿病腦病病理生理學機制尚未完全闡明。現(xiàn)有研究表明，神經細胞的變性、凋亡導致中樞神經細胞的數(shù)目減少是癡呆及其它中樞神經退行性疾病發(fā)生認知功能障礙的重要病理基礎［10］。神經營養(yǎng)因子是參與糖尿病腦病發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。神經營養(yǎng)因子(neurotrophin，NT)是一類由神經元、神經所支配的組織和星形膠質細胞產生的，且為神經元生長與存活所必需的蛋白質分子，具有支持神經元生長、發(fā)育和功能完整性的作用，包含神經生長因子、BDNF和神經營養(yǎng)素等。其中BDNF及其受體主要是在中樞神經系統(tǒng)內表達，其中海馬和皮質的含量最高。BDNF在神經系統(tǒng)的發(fā)育、分化、生長和維持神經元正常的生理功能起關鍵作用。敲低BDNF的表達，小鼠的學習能力及記憶能力大大降低，從而說明了 BDNF可能參與了空間學習及記憶過程。另有證據(jù)表明，BDNF在糖尿病模型大鼠海馬中的表達下降，提示BDNF可能參與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展［11］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，盡管在體外培養(yǎng)的神經元中50 mM的高糖刺激并未導致BDNF表達的下降，但導致培養(yǎng)液中BDNF含量的下降。這提示，高糖導致BDNF分泌減少，進而導致BDNF與其trkB受體結合減少，致使其不能發(fā)揮神經元保護效應，最終導致細胞凋亡。

因此，尋找有效的藥物，抑制高糖所致的神經元損傷顯得尤為必要。Sal是紅景天的主要活性成分，其在抗衰老、調節(jié)新陳代謝、雙向調節(jié)血糖、抗疲勞、提高中樞興奮性、抗輻射等方面有顯著療效［12］。有實驗證據(jù)證實Sal對糖尿病大鼠學習功能及記憶功能的改善作用，但其作用機制尚未闡明。本研究結果顯示，Sal可以顯著抑制高糖所致的細胞凋亡標志蛋白cleaved caspase 3的表達，同時紅景天苷可以誘導BDNF的表達及其在培養(yǎng)液中的含量。這提示紅景天苷可以通過增強BDNF的信號傳導發(fā)揮其神經元的保護作用。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)紅景天苷可以通過抑制活性caspase 3和促進BDNF表達和分泌，進而抑制高糖所致的神經元損傷。該研究為臨床治療糖尿病腦病提供一定的理論基礎。

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