楊潤強(qiáng) 王淑芳 顧振新

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京 210095）

麥胚內(nèi)源蛋白酶主要特性研究

楊潤強(qiáng) 王淑芳 顧振新

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京 210095）

研究了麥胚蛋白酶的主要特性。結(jié)果顯示：麥胚蛋白酶主要被飽和度為20%～60%的硫酸銨沉淀，其水解酪蛋白的最佳反應(yīng)溫度為50℃，30℃保溫30 min其活性無顯著下降；麥胚蛋白酶活性在pH為5.5和7.5時較高，且在pH 5.5條件下放置30 min其活性無顯著下降。pH 5.5時，Mg2＋、Mn2＋、Ba2＋、胃酶抑素A（Pepstatin A）、碘乙酸（IAA）、芐磺酰氟（PMSF）和乙二胺四乙酸（EDTA）強(qiáng)烈抑制其活性，而 Li＋、Ca2＋、Cu2＋、2－ME和二硫蘇糖醇（DTT）顯著促進(jìn)其活性。pH 7.5時，Pepstatin A、IAA、PMSF和EDTA顯著抑制蛋白酶活性。pH 5.5和7.5時，麥胚蛋白酶對酪蛋白的Km分別為0.562和4.935 mg／mL，且親和力比以牛血清蛋白、卵清蛋白和明膠為底物時高。麥胚蛋白酶主要為半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。

麥胚 內(nèi)源蛋白酶 主要特性

種子發(fā)芽過程中，內(nèi)源蛋白酶被激活可將儲藏蛋白水解為可溶性蛋白、多肽和氨基酸，這對胚芽發(fā)育起重要作用［1－2］。天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶4組蛋白酶存在于發(fā)芽大麥和綠麥芽中，這些蛋白酶的催化機(jī)制不同且可被不同的抑制劑所抑制［3］。

通過微生物發(fā)酵制備的工業(yè)用蛋白酶因混入了一些微生物毒素而存在著使用不安全的因素［4］，而植物蛋白酶具有無毒無害的優(yōu)點(diǎn)。Ratnaparkhe等［5］研究了火炬松種子在發(fā)芽、發(fā)芽完成及幼苗形成過程中金屬蛋白酶的表達(dá)特性。Ogbonna等［6］從高粱麥芽 KSV8－11中純化到一種蛋白酶。Timotijevic′等［7］從蕎麥種子中發(fā)現(xiàn)了幾種天冬氨酸蛋白酶。然而，對小麥胚芽內(nèi)源蛋白酶的研究不多［8］。

小麥磨粉過程中剔除的麥胚，其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)30%，但是目前沒有得到充分利用。近年來，有關(guān)以麥胚蛋白為原料制備生物活性肽，如抗氧化肽［9］、降血壓肽［10］的研究報道居多，但是鮮見麥胚蛋白酶特性研究報道。本試驗(yàn)對麥胚內(nèi)源蛋白酶基本特性進(jìn)行了初步研究，旨在為利用麥胚內(nèi)源蛋白酶降解自身蛋白制備麥胚生物活性肽提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥胚芽：中國徐州同源面粉有限公司。麥胚于－20℃保存待用。酪蛋白、明膠、碘乙酸（IAA）、胃酶抑素A（Pepstatin A）、乙二胺四乙酸（EDTA）、芐磺酰氟（PMSF）：美國Sigma公司。

1.2 粗酶液提取

蛋白酶的提取參照 Wen等［11］的方法。取2 g麥胚，加10 mL檸檬酸 －磷酸氫二鈉緩沖液（含5 mmol／L巰基乙醇），研磨勻漿，6 000×g冷凍離心30 min，取上清液，用于蛋白酶活力分析。

1.3 蛋白酶初步純化

準(zhǔn)確量取一定體積的酶提取液，然后緩慢加入相應(yīng)飽和度（從0～100%）的固體硫酸銨并緩慢攪拌，靜置1 h后，6 000×g離心30 min，整個過程在4℃條件下進(jìn)行。測定上清液中殘留的酶活力和酶蛋白含量。沉淀于－20℃保存待用。

1.4 蛋白酶酶學(xué)特性分析

1.4.1 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

量取1.0 mL粗酶液與1.0 mL質(zhì)量濃度為20 mg／mL的酪蛋白在30～80℃范圍內(nèi)反應(yīng)10 min，然后測定蛋白酶活力。蛋白酶溫度穩(wěn)定性測定是在測定活力前，酶液在不同溫度下放置30 min后用酪蛋白法測定蛋白酶活力。

1.4.2 最適反應(yīng)pH和酸堿穩(wěn)定性

量取1.0 mL粗酶液與1.0 mL質(zhì)量濃度為20 mg／mL的酪蛋白在pH 2.5～9.5范圍內(nèi)反應(yīng)10 min（50℃），然后測定蛋白酶活力。蛋白酶pH穩(wěn)定性測定是在測定活力前，酶液在不同pH下孵育30 min后用酪蛋白法測定蛋白酶活力。

1.4.3 金屬離子對酶活力的影響

酶液分別與 Li＋、Ca2＋、Cu2＋、Zn2＋、Mg2＋、Mn2＋和Ba2＋混合后用酪蛋白法測定酶活力。反應(yīng)液中金屬離子的終物質(zhì)的量濃度為2 mmol／L。

1.4.4 添加物對酶活力的影響

酶液分別與 Pepstatin A、IAA、PMSF、EDTA、L－cysteine、GSH、β－ME、和 DTT混合后用酪蛋白法分別在pH 5.5和7.5條件下測定酶活力。以未加任何添加物所測得的活力為對照（100%）。

1.4.5 底物特異性

分別以酪蛋白、明膠、牛血清蛋白和卵清蛋白為底物，分別在pH 5.5和7.5條件下用游離氨基酸法測定酶活力，各底物的質(zhì)量濃度為20 mg／mL。以酪蛋白為底物時的酶活力為對照（100%）。

1.4.6 米氏常數(shù)

采用雙倒數(shù)作圖的方法測定米氏常數(shù)。分別在pH 5.5和7.5條件下測定酶反應(yīng)速率，然后擬合反應(yīng)曲線并計算米氏常數(shù)（Km）。

1.5 蛋白酶活力測定

1.5.1 酪蛋白法

在Wen等［11］提供的蛋白酶活力測定方法的基礎(chǔ)上稍作修改。以酪蛋白溶液（質(zhì)量濃度為20 mg／mL）作為底物，1 mL的底物溶液和1 mL的酶提取液在50℃下保溫反應(yīng)10 min，之后在90℃水浴中保溫5 min以滅酶，然后加入 2 mL TCA（0.6 mol／L）溶液，于室溫下沉淀未反應(yīng)的蛋白質(zhì)，時間為15 min左右。蛋白酶活力是通過測定A275的增加值來計算，即1 g麥胚酶提取液每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力。對照管與上述所加組分相同，但在酶反應(yīng)前加入TCA溶液。

1.5.2 游離氨基酸法

酶水解酪蛋白、明膠、牛血清蛋白和卵蛋白，然后測定游離氨基酸含量［12］。1 mL粗酶液加入4 mL 0.1 mol／L檸檬酸緩沖液和1 mL質(zhì)量濃度為20 mg／mL的酪蛋白，50℃條件下保溫1 h，然后加入2 mL 0.6 mol／L的三氯乙酸終止反應(yīng)。離心后，2 mL上清液加入3 mL茚三酮溶液后煮沸15 min，然后用15 mL 60%的乙醇溶液定容。570 nm下測定吸光值，計算出增加的游離氨基酸量，以亮氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)。1 h產(chǎn)生1μg游離氨基酸定義為1個酶活力單位。

1.6 可溶性蛋白含量測定

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用考馬斯亮藍(lán)G－250法測定［13］。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用SPSS 18.0進(jìn)行顯著性分析，n＝3，顯著水平為P＜0.05和P＜0.01；結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶初步純化

粗蛋白酶采用硫酸銨分級沉淀法純化。結(jié)果顯示（圖1），在硫酸銨飽和度為0～20%范圍內(nèi)，粗提液中蛋白酶活力無顯著變化，在硫酸銨飽和度為20%～60%范圍內(nèi)，蛋白酶活力急劇下降；隨著硫酸銨飽和度的增加，蛋白質(zhì)含量成直線下降趨勢。90%左右的酶活力集中于由20%～60%硫酸銨飽和度所沉淀的蛋白質(zhì)中。硫酸銨分級沉淀后，大部分雜蛋白被除去，麥胚內(nèi)源蛋白酶得以純化。

圖1 不同硫酸銨飽和度沉淀后對殘余酶活力和蛋白質(zhì)的影響

2.2 最適溫度和熱穩(wěn)定性

隨著酶作用溫度的升高，麥胚蛋白酶活力呈先升高后下降的趨勢，其最適反應(yīng)溫度為50℃（圖2a）。當(dāng)?shù)鞍酌赣?0℃水浴保溫30 min后，活力無顯著下降（P＜0.05），但是在高于30℃時，蛋白酶活力緩慢下降（圖2b）。當(dāng)酶處于低溫條件下，其活力未被激活而較低；但是處于過高溫度下時，酶蛋白因空間結(jié)構(gòu)被破壞而失去催化活性，合適的反應(yīng)溫度對于酶反應(yīng)至關(guān)重要。本研究的麥胚蛋白酶最適反應(yīng)溫度與Singh等［14］的研究相似。有研究發(fā)現(xiàn)休眠黑麥種子蛋白酶最適溫度為40～45℃，且在60℃條件下保溫150 min，其蛋白酶活力為最初活力的40%［15］。麥胚蛋白酶反應(yīng)環(huán)境溫度溫和，且不耐熱。

圖2 溫度對酶活力及其穩(wěn)定性的影響

2.3 最適pH和pH穩(wěn)定性

由圖3a可知，以酪蛋白為底物，麥胚蛋白酶具有pH 5.5和pH 7.5 2個催化組分。隨著pH值的升高，蛋白酶活力先升高，然后急劇下降。當(dāng)pH 7.0時，酶活力僅為pH 5.5時的50%左右，可能是因?yàn)榇痔嵋褐械鞍酌阜N類復(fù)雜，在pH 7.0各種蛋白酶活力均較低。在堿性條件下，pH 7.5時的蛋白酶活力均高于其他pH下的活力。圖3b顯示，當(dāng)?shù)鞍酌冈趐H 5.5條件下保溫30 min后，其活力無顯著下降，而在其他pH條件下保溫30 min后酶活力顯著下降?？梢娺^低或過高的pH都會導(dǎo)致蛋白酶失活。

有研究發(fā)現(xiàn)，在大麥中，天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶以及金屬蛋白酶最適反應(yīng)條件為酸性、中性及堿性條件［3］。本研究中蛋白酶在pH 5.5和7.5時具有較高活性。有研究報道，小麥、高粱和大麥半胱氨酸蛋白酶的最適反應(yīng)pH分別為 4.0［12］、3.8［6］及 4.0［16］，絲氨酸蛋白酶的最適pH分別為 7.5［17］、7.9［18］及 8.0［19］。

圖3 pH對蛋白酶活力及穩(wěn)定性的影響

2.4 金屬離子對蛋白酶活力的影響

從表1可以看出，在pH為5.5時，2 mmol／L的Li＋、Ca2＋和 Cu2＋使蛋白酶活力分別提高 10.69%、13.31%和 100.07%，而 Mg2＋、Mn2＋和 Ba2＋使蛋白酶活力分別降低5.52%、4.72%和9.64%；當(dāng)pH為7.5時，Cu2＋顯著激活蛋白酶活力，而 Zn2＋、Mn2＋和Ba2＋強(qiáng)烈抑制其活力。

表1 金屬離子對蛋白酶活力的影響

某些金屬離子作為酶的輔酶是通過改變酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響酶的活性。業(yè)已證明Cu2＋和Ca2＋能有效促進(jìn)蛋白酶活力，而某些重金屬離子嚴(yán)重抑制蛋白酶活力［6］。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng) pH 5.5時，Cu2＋顯著促進(jìn)蛋白酶活力，這與Fahmy等［12］報道的結(jié)果相反，可能是由于酶反應(yīng)體系不同所導(dǎo)致。當(dāng)pH 7.5時，金屬離子對蛋白酶的影響輕微，說明金屬離子不為絲氨酸蛋白酶所必需。

2.5 添加物對蛋白酶活力的影響

從表2可以看出，在pH 5.5和pH 7.5，Pepstatin A、IAA、PMSF和EDTA均抑制麥胚蛋白酶活力。當(dāng)pH 5.5時，碘乙酸對蛋白酶活力有明顯的抑制作用，當(dāng)pH 7.5時，PMSF明顯抑制蛋白酶活力。β－ME和DTT在pH 5.5時明顯促進(jìn)蛋白酶活力，而其他物質(zhì)對蛋白酶活力沒有顯著影響。說明麥胚蛋白酶中存在4種蛋白酶。IAA和PMSF分別在pH 5.5和pH 7.5時顯著抑制麥胚蛋白酶活性，這表明主要的蛋白酶種類為半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。Fahmy等［12］報道了小麥半胱氨酸蛋白酶能被碘乙酸鹽（iodoacetate）和p－HMB強(qiáng)烈抑制，最適反應(yīng)溫度為50℃。Wang等［20］從小麥種子中發(fā)現(xiàn)了絲氨酸蛋白酶，其活性被PMSF強(qiáng)烈抑制。在其他植物中也發(fā)現(xiàn)了絲氨酸蛋白酶如鐵海棠［18］、蘑菇［17］等。在小麥中，天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶的研究鮮見報道。而 Fontanini等［21］和 Jones［3］從綠麥芽中分離得到一種堿性蛋白酶，此蛋白酶為金屬蛋白酶且最適反應(yīng)pH為8.0。本研究中，pepstatin A和EDTA分別在pH 5.5和7.5時對蛋白酶有輕微的抑制作用，表明少量的天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶存在于小麥胚芽中。

表2 添加物對麥胚蛋白酶活力的影響

2.6 對不同底物的水解能力

麥胚蛋白酶對不同底物的水解能力由表3顯示。pH 5.5時，蛋白酶對不同底物的親和力順序?yàn)槔业鞍?、牛血清蛋白、明膠和卵蛋白。而當(dāng)pH 7.5時，蛋白酶對不同底物的親和力順序?yàn)槔业鞍?、牛血清蛋白、卵蛋白和明膠。在不同的pH條件下，酶的活性及底物溶解度不同。本研究中蛋白酶種類復(fù)雜，且具有不同的反應(yīng)pH值，從而導(dǎo)致酶對不同底物的水解能力截然不同。Jaouadi等［22］研究結(jié)果顯示，短小芽孢桿菌堿性蛋白酶對不同底物的水解能力順序?yàn)椋豪业鞍祝?00%）＞明膠（95%）＞偶氮酪蛋白（80%）＞角質(zhì)素（65%）＞偶氮角質(zhì)素（63%）＞牛血清蛋白（52%）＞麥谷蛋白（20%）＞卵清蛋白（15%）。本研究中，麥胚蛋白酶對酪蛋白的水解能力均大于明膠、牛血清蛋白及卵清蛋白。

表3 麥胚蛋白酶對不同底物的相對活力

2.7 動力學(xué)常數(shù)

圖4顯示，當(dāng)pH為5.5和7.5時，麥胚蛋白酶對酪蛋白的米氏常數(shù)分別為0.562和4.935 mg／mL，說明麥胚蛋白酶在酸性條件下對酪蛋白的親和力比堿性條件下高。通過專一抑制劑對酶活力影響可知，麥胚蛋白酶由天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶4種蛋白酶組成，其米氏常數(shù)受許多因素影響，如底物種類、測定時的pH值等。在pH 8.0條件下，以偶氮清蛋白及N－succinyl－Ala－Ala－Ala－p－nitroanilide為底物時，乳膠半胱氨酸蛋白酶的 Km分別為（22.0±0.5）mmol／L及（4.1±0.25）mmol／L［23］，表明特定的蛋白酶對不同底物的Km值不同。Yadav等［18］報道，以酪蛋白為底物，鐵海棠絲氨酸蛋白酶的Km為33.3μmol／L。本研究中，麥胚蛋白酶Km值為0.562 mg／g及4.935 mg／g，可能是由于在不同pH條件下各種蛋白酶被激活的程度不同。

圖4 pH 5.5及pH 7.5時酶的Km值

3 結(jié)論

麥胚中存在天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶及金屬蛋白酶，其中以半胱氨酸蛋白酶及絲氨酸蛋白酶為主，兩者最適反應(yīng)溫度均為50℃，最適反應(yīng)pH分別為5.5和7.5，當(dāng)pH 5.5時，麥胚蛋白酶可被Cu2＋、Ca2＋及 Li＋強(qiáng)烈激活，當(dāng) pH 7.5時，被 Zn2＋強(qiáng)烈抑制。麥胚蛋白酶對酪蛋白的親和力高于牛血清蛋白、卵蛋白和明膠，且pH 5.5時麥胚蛋白酶對酪蛋白的親和力高于pH 7.5時的親和力。

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Main Properties of Wheat Germ Endogenous Protease

Yang Runqiang Wang Shufang Gu Zhenxin

（College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095）

Proteases properties of wheat germ were investigated in the paper.Proteolytic enzymes in the wheat germ extract were proved to be concentrated in 20%～60%saturation of ammonium sulfate precipitate.Casein was utilized as substrate，and the preliminarily purified protease could found to have the optimal activity at 50℃，maximal temperature stability at 30℃.The protease had a higher activity at pH 5.5 and pH 7.5.It could keep the maximum activity for 30 min at pH 5.5.The protease was inhibited by Mg2＋，Mn2＋，Ba2＋，pepstatin A，IAA，PMSF and EDTA，and stimulated by Li＋，Ca2＋，Cu2＋，2－ME and DTT.In addition，with casein as substrate，pepstatin A，IAA，PMSF and EDTA decreased protease activity significantly at pH 7.5.At pH 5.5 and 7.5，the enzyme had Kmof 0.562 and 4.935 mg／mL，respectively.The protease had the higher affinity to casein than bovine serum albumin，ovalbumin and gelatin.As a result，wheat germ proteases mainly were cysteine protease and serine protease.

wheat germ，endogenous protease，main properties

Q556＋.3

A

1003－0174（2015）09－0001－06

2014－04－23

楊潤強(qiáng)，男，1984年出生，講師，食品中功能成分的富集技術(shù)

顧振新，男，1956年出生，教授，生物技術(shù)與功能食品