田童童 江 英 張 建 王由美 魏永輝 張?jiān)氯?楊金月

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子 832000）

花蕓豆鐵蛋白的分離純化

田童童 江 英 張 建 王由美 魏永輝 張?jiān)氯?楊金月

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，石河子 832000）

為了從花蕓豆中獲取純化的植物鐵蛋白，試驗(yàn)利用鹽析及柱層析對(duì)花蕓豆中的鐵蛋白進(jìn)行分離純化。研究表明，鐵蛋白提取的最佳工藝條件為：提取溫度53.79℃，樣液pH值為7.23，氯化鎂濃度511.15 mmol／L，檸檬酸三鈉濃度為685.24 mmol／L。該條件下模型預(yù)測(cè)花蕓豆中鐵蛋白的含量為4.40 mg／g，實(shí)際試驗(yàn)值為（4.27±0.09）mg／g。經(jīng)DEAE－Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephacryl S－500分子篩柱純化得到的電泳純鐵蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為560 000，且只含有1種亞基，其相對(duì)分子質(zhì)量為27 000。通過(guò)Western－Blot法對(duì)純化所得的花蕓豆蛋白質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果確定該蛋白質(zhì)為鐵蛋白。

花蕓豆 鐵蛋白 分離 純化

鐵蛋白具有調(diào)節(jié)鐵代謝平衡和解除亞鐵離子毒性的雙重功效。從細(xì)菌到植物再到人的鐵蛋白，其結(jié)構(gòu)非常保守［1－2］。鐵蛋白是由24個(gè)亞基組成的中空球狀分子，每2個(gè)亞基反向平行形成1組，再由這12組亞基對(duì)構(gòu)成1個(gè)近似正八面體，成4－3－2倍軸對(duì)稱。1個(gè)鐵蛋白分子中可貯存4 500個(gè)無(wú)機(jī)三價(jià)鐵化合物。脊椎動(dòng)物鐵蛋白分子中存在重鏈和輕鏈2種類型亞基，每個(gè)亞基都由1個(gè)4α螺旋簇和1個(gè)短螺旋簇構(gòu)成，其中重鏈型亞基包括1個(gè)亞鐵氧化紅心，能夠快速氧化亞鐵離子［3－5］。

植物鐵蛋白被認(rèn)為是21世紀(jì)新型的補(bǔ)鐵功能因子［6］。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的植物中，只有豆科類植物是將其近90%的鐵儲(chǔ)藏于種子的鐵蛋白中［7］。鐵是生物體生存所必需的礦物質(zhì)元素［8］。據(jù)世界衛(wèi)生組織2005年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全球大約有35億人缺鐵。天然的鐵蛋白具有貯藏大量的鐵和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵的動(dòng)態(tài)平衡的雙重作用。它可以形成血紅素、鐵硫原子簇，這使得其在呼吸作用、氮的固定等生理代謝過(guò)程中起著舉足輕重的作用［9－11］。

花蕓豆（PhaseolusvulgarisLinn.sp）屬豆科菜豆屬一年生草本植物，其生物學(xué)名叫菜豆，其中鐵含量尤其豐富［12］?；ㄊ|豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其氨基酸譜與FAO建議的理想蛋白質(zhì)必需氨基酸模式譜比較，除甲硫氨酸外，其余均高出22%～63%，其中賴氨酸高出 31%～47%［13］。

因此，本試驗(yàn)以花蕓豆為研究對(duì)象，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化鐵蛋白的提取工藝，且采用層析法對(duì)其進(jìn)一步純化，以期為植物鐵蛋白的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

花蕓豆：石河子市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、考馬斯亮藍(lán)R－250、十二烷基硫酸鈉（SDS）和四甲基乙二胺（TEMED）：美國(guó)Sigma公司。

DEAE－Sepharose和Sephacryl S－500：美國(guó)GEHealthcare Bio－Sciences AB公司；PVDF膜：美國(guó)millipore公司；Mini－proteinⅢ：美國(guó)Bio－Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 花蕓豆粗蛋白的制備

稱取1 kg花蕓豆浸泡于4℃雙蒸水中處理24 h。去皮后傾倒于 2倍體積的 PBS（0.05 mol／L KH2PO4－Na2HPO4，pH 7.0，1%PVP）中，30 min后勻漿2 min，過(guò)濾。清液于55℃下水浴10 min，冷卻至室溫，于3 500 r／min離心15 min，上清液即為粗提液［14］。

1.2.2 粗提液的鹽析

在粗提液中加入MgCl2晶體使其終物質(zhì)的量濃度為500 mmol／L，靜置20 min后加入檸檬酸三鈉晶體使其終物質(zhì)的量濃度為700 mmol／L，然后于4℃下靜置過(guò)夜。在12 000 r／min，4℃下離心30 min，此時(shí)的花蕓豆鐵蛋白不再溶于上清液。加入2倍體積上清液，離心10 min，棄上清，重復(fù)3～4次直至只有褐色沉淀。將沉淀溶于2倍體積蒸餾水中，離心30 min，棄上清。重復(fù)2次用5倍體積蒸餾水溶解沉淀，離心30 min，合并上清液?；ㄊ|豆鐵蛋白鹽析后的溶液用pH 7.5的PBS緩沖液進(jìn)行透析，透析液經(jīng)抽濾后進(jìn)行弱陰離子交換柱層析。

1.2.3 柱層析

1.2.3.1 陰離子交換柱層析

用 PBS（pH 7.5）平衡 DEAE－Sepharose Fast Flow后，將樣液上柱（1.6 cm×25 cm），用4倍體積PBS洗脫，再用含0～0.8 mol／L NaCl的600 mL PBS進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL／min，每管5 mL，分管收集。將具有鐵蛋白活性的收集液超濾濃縮到5 mL，以待進(jìn)一步純化。

1.2.3.2 凝膠過(guò)濾柱層析

用含有0.15 mol／L NaCl的 PBS平衡 Sephacryl S－500，待上柱（1.6 cm×50 cm）后，再用含有0.15 mol／L NaCl的 PBS洗脫，流速為 0.5 mL／min，每管 5 mL，分管收集。

1.2.4 Ferrozine試劑法測(cè)定Fe濃度

用微量移液器取20μL待測(cè)溶液，加入250μL 30%TCA，再加入超純水使總體積達(dá)到1 mL。再于10 000 r／min離心1 min。取700μL上清液于新離心管中，依次向其中加入100μL飽和乙酸銨，62.5 μL 0.12 mol／L抗壞血酸，62.5μL 0.25 mol／L Ferrozine，最后加入超純水使總體積達(dá)到1 mL。4 h后，在562 nm下比色，得到吸光值A(chǔ)562nm，即可用于表示鐵含量（μg／dL）［15］。

1.2.5 Native－PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)分子純度

用樣品緩沖液以1∶2（V／V）的比例稀釋樣品，樣品緩沖溶液中含有25%甘油，12.5%pH 6.8，0.5 mol／L Tris－HCl，1%溴酚藍(lán)，充分混合后參照 Laemmli方法進(jìn)行 Native－PAGE［16］。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法進(jìn)行染色［17］。

1.2.6 SDS－PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)亞基純度

聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）參照Chalkley等［18?＼報(bào)道的方法進(jìn)行試驗(yàn)。樣品分子質(zhì)量的確定根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的相對(duì)遷移率計(jì)算獲得。

1.2.7 蛋白免疫印跡（Western－Blot）

1.2.7.1 SDS－PAGE電泳

將純化后的蛋白質(zhì)參照1.2.6部分電泳。

1.2.7.2 電轉(zhuǎn)移

將1.2.7.1獲得的電泳膠裁剪成適當(dāng)大小，從上往下黑面、纖維板、濾紙、電泳膠、PVDF膜、濾紙、纖維板、白面依次放好，置于電泳槽中，于4℃條件下（100 mV，3 h）轉(zhuǎn)膜。

1.2.7.3 曝光顯影

將1.2.7.2得到的電泳條帶切成合適大小，用麗春紅染色0.5～1 min，依次用水、電轉(zhuǎn)液、水和TBST沖洗干凈；用含 2.5／100（m／V）無(wú)抗乳粉的TBST室溫下封閉2 h；加入一抗后置于4℃冷藏柜中過(guò)夜，然后用TBST沖洗干凈后；加入二抗后置于4℃冷藏柜中過(guò)夜，仍然用TBST沖洗干凈，然后用純水洗去TBST；膜與底物放映5 min后直接放與暗匣黑暗操作；曝光3 min、顯影液中漂洗3 min、定影液中漂洗1～3 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 花蕓豆鐵蛋白提取條件的優(yōu)化

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)可能影響花蕓豆鐵蛋白提取的4個(gè)因素（浸提液pH值、氯化鎂物質(zhì)的量濃度、檸檬酸三鈉物質(zhì)的量和提取溫度）進(jìn)行詳細(xì)的單因素試驗(yàn)分析，結(jié)果表明，在浸提液的 pH值7.0，氯化鎂物質(zhì)的量濃度500 mmol／L，檸檬酸三鈉物質(zhì)的量濃度700 mmol／L及加熱溫度55℃的條件下花蕓豆鐵蛋白含量為（3.89±0.07）mg／g。

在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，為了得到花蕓豆鐵蛋白提取的最優(yōu)工藝參數(shù)，利用響應(yīng)面分析法對(duì)鐵蛋白的提取做了進(jìn)一步的優(yōu)化。響應(yīng)面分析因素水平編碼如表1所示，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果如表3所示。

表1 鹽析法提取鐵蛋白響應(yīng)面分析因素水平編碼表

表2 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

當(dāng)P＜0．05時(shí)，影響因素對(duì)響應(yīng)值影響為差異顯著，當(dāng)P＜0．001時(shí)為差異高度顯著，P＜0．000 1時(shí)為差異極顯著［19］。表 3中顯示模型的P＜0．000 1，說(shuō)明試驗(yàn)?zāi)Ｐ途哂懈叨鹊娘@著性，失擬項(xiàng)的P＝0．438 4＞0．05，不顯著，表明響應(yīng)面設(shè)計(jì)的模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，模型的相關(guān)系數(shù)R2＝93．86%，更加說(shuō)明該模型的可信度較高。由表3可知，X1的P＝0．008 3＜0．05，表明 pH值起著顯著性的影響；X1的P＝0．025 1＜0．05，與X2相比不是很顯著，說(shuō)明溫度的影響次于pH值。各個(gè)因素經(jīng)過(guò)回歸擬合后，經(jīng)解得到的鐵蛋白提取量的回歸方程為：

通過(guò)軟件求解方程，得出最優(yōu)工藝條件為溫度53.79℃、pH為 7.23、氯化鎂物質(zhì)的量濃度為511.15 mmol／L、檸檬酸三鈉物質(zhì)的量濃度685.24 mmol／L，此時(shí)鐵蛋白達(dá)到4.40 mg／g。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?，課題組做了驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示鐵蛋白提取率為（4.27±0.09）mg／g，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。

響應(yīng)面分析方法的圖形是特定的響應(yīng)面（Y）與對(duì)應(yīng)的因素X1、X2、X3、X4構(gòu)成的1個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖，每個(gè)響應(yīng)面對(duì)其中2個(gè)因素進(jìn)行分析，另外2個(gè)因素固定在零水平。從中可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，從試驗(yàn)所得的響應(yīng)面分析圖上可以找到它們?cè)谔崛∵^(guò)程中的相互作用，花蕓豆鐵蛋白提取回歸優(yōu)化響應(yīng)曲面如圖1所示。

由圖1可知，溫度、pH值、氯化鎂濃度和檸檬酸三鈉濃度4個(gè)因素之間相互作用對(duì)花蕓豆鐵蛋白含量均呈現(xiàn)出顯著的二次效應(yīng)。結(jié)合方差分析表3中二次項(xiàng)的P值均小于0.01，表明各個(gè)因素之間的交互作用極顯著。從圖1a中可知溫度與pH值對(duì)鐵蛋白含量的影響曲面較陡，說(shuō)明溫度與pH值的交互影響顯著，pH和檸檬酸三鈉的交互影響僅次于溫度與pH，如圖1e所示。由圖1b和圖1d及方差分析表3可知，溫度與氯化鎂及pH值與氯化鎂之間的交互作用程度是相同的。由圖1c和圖1f可知，溫度與檸檬酸三鈉濃度及氯化鎂和檸檬酸三鈉濃度之間的交互影響作用最小。綜上所述，影響花蕓豆鐵蛋白提取的各個(gè)因素之間既有相互促進(jìn)的效果，又有相互制約的作用，說(shuō)明在分離提取花蕓豆鐵蛋白時(shí)，要細(xì)致全面的考慮各因素之間的影響作用，要做到利用促進(jìn)作用避免抑制作用，進(jìn)而達(dá)到最佳的提取效果。

圖1 花蕓豆鐵蛋白提取響應(yīng)曲面圖

2.2 花蕓豆鐵蛋白的純化

花蕓豆鐵蛋白樣品經(jīng)DEAE－Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和Sephacryl S－500分子篩柱洗脫圖譜分別如圖2～圖3所示?；ㄊ|豆鐵蛋白純化過(guò)程中的電泳圖譜如圖4所示。

由圖2可知，花蕓豆鐵蛋白樣品經(jīng)過(guò)DEAESepharose陰離子交換層析后得到1個(gè)較為明顯的吸收峰，經(jīng)電泳檢測(cè)后顯示該峰下的蛋白質(zhì)為雜質(zhì)蛋白，如圖4a所示。將蛋白含量較高的收集管合并，超濾濃縮至5 mL，然后經(jīng)過(guò)Sephacryl S－500分子篩柱進(jìn)行層析純化。由圖3可知，凝膠層析后得到1個(gè)花蕓豆鐵蛋白吸收峰，經(jīng)SDS－PAGE電泳檢測(cè)得知該峰下的蛋白質(zhì)為電泳純的花蕓豆鐵蛋白，且只含有1個(gè)亞基，其相對(duì)分子質(zhì)量約為27 000，如圖4b所示。凝膠層析純化后的鐵蛋白經(jīng)過(guò)Native－PAGE檢測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為560 000，如圖5所示。

圖2 花蕓豆粗鐵蛋白經(jīng)DEAE－Sepharose陰離子交換柱洗脫圖譜圖

圖3 花蕓豆粗鐵蛋白經(jīng)Sephacryl S－500凝膠層析柱的洗脫圖譜

圖4 花蕓豆鐵蛋白純化過(guò)程中的SDS－PAGE電泳圖譜

圖5 經(jīng)過(guò)Sephacryl S－500凝膠層析柱后鐵蛋白樣品的Native－PAGE電泳圖譜

圖6 花蕓豆鐵蛋白Western－Blot分析結(jié)果

蛋白免疫采用的是抗體免疫反應(yīng)，然后抗體再和二抗（其自身的抗體，具有顯色作用）結(jié)合，如果樣品中存在特定蛋白，經(jīng)過(guò)曝光反應(yīng)后，會(huì)發(fā)生顯影。反之，則不會(huì)發(fā)生變化。將從花蕓豆中純化的鐵蛋白經(jīng)過(guò)SDS－PAGE分離后，其中一塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，如圖6a所示。另一塊凝膠中鐵蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上與其抗體發(fā)生反應(yīng)，然后再與二抗反應(yīng)，最后曝光顯影。經(jīng)過(guò)顯影后發(fā)現(xiàn)膠片上在相對(duì)分子質(zhì)量為27 000處有條帶，如圖6b所示，說(shuō)明純化的蛋白為鐵蛋白。

3 結(jié)論

3.1 花蕓豆鐵蛋白提取分離的最佳工藝參數(shù)為：溫度53.79℃、pH為7.23、氯化鎂物質(zhì)的量濃度為511.15 mmol／L、檸檬酸三鈉物質(zhì)的量濃度685.24 mmol／L，此時(shí)花蕓豆粕中鐵蛋白的提取率達(dá)到4.40 mg／g。經(jīng)驗(yàn)證，結(jié)果顯示鐵蛋白提取率為（4.27±0.09）mg／g，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。

3.2 樣品經(jīng)陰離子交換層析后出現(xiàn)1個(gè)吸收峰，該處的樣品經(jīng)SDS－PAGE電泳后顯示蛋白峰為雜質(zhì)蛋白峰。將該段時(shí)間收集的蛋白液超濾濃縮至5 mL，然后上分子篩柱分離純化，收集樣品得到目標(biāo)蛋白。經(jīng)柱層析分離、純化所得的花蕓豆鐵蛋白達(dá)到電泳級(jí)，且只有一種相對(duì)分子質(zhì)量為27 000的亞基。從花蕓豆中分離純化的蛋白質(zhì)為鐵蛋白。

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Isolation and Purification of Ferritin from the Phaseolus vulgaris

Tian Tongtong Jiang Ying Zhang Jian Wang Youmei Wei Yonghui Zhang Yueru Yang Jinyue

（Food College of Shihezi University，Shihezi 832000）

In order to obtain the purified phytoferritin from thePhaseolusvulgaris，ferritin was isolated and purified through salting out method and column chromatography.As a result，the ferritin yield was up to（4.27±0.09）mg／g under the condition that extraction temperature 53.79℃，sample solutions pH 7.23，concentration of MgCl2511.15 mmol／L，concentration of sodium citrate 685.24 mmol／L.Ferritin of electrophoresis level，the molecular weight of 560 000，was obtained by further chromatographic purification which contains only one subunit of 27 000.Simultaneously，protein extracted from the phaseolus vulgaris was identified with the help of the Western Blot.The result revealed that the protein was ferritin.

phaseolusvulgaris，ferritin，isolation，purification

Q51

A

1003－0174（2015）09－0030－06

時(shí)間：2015－06－01 17：38

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／11.2864.TS.20150601.1738.001.html

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技支疆專項(xiàng)計(jì)劃（2010ZJ13），石河子大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2011ZRKXTD－0803），石河子大學(xué)青年骨干教師培訓(xùn)（3152SPXY01027）

2014－09－15

田童童，男，1990年出生，碩士，食品生物化學(xué)

張建，男，1979年出生，副教授，食品生物化學(xué)