汪敏訥，許小毛，翟振國，孫 亮，方保民，肖 飛，郭 健

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京1007302北京醫(yī)院衛(wèi)生部臨床檢驗中心，北京1007303北京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京1007304首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院北京呼吸疾病研究所北京市呼吸和肺循環(huán)疾病重點實驗室，北京1000205北京醫(yī)院北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京100730

KLKB1基因多態(tài)性與肺血栓栓塞癥的相關(guān)性

汪敏訥1，2，許小毛3，翟振國4，孫 亮5，方保民3，肖 飛5，郭 健5

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京100730
2北京醫(yī)院衛(wèi)生部臨床檢驗中心，北京100730
3北京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京100730
4首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院北京呼吸疾病研究所北京市呼吸和肺循環(huán)疾病重點實驗室，北京100020
5北京醫(yī)院北京老年醫(yī)學(xué)研究所，北京100730

目的 研究KLKB1基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與肺動脈栓塞癥(PTE)的關(guān)聯(lián)。方法 以確診的95例PTE患者為PTE病例組，以90名健康體檢者為對照組，采用χ2檢驗、Logistic回歸分析對SNP位點的基因型頻率、等位基因和單倍體型進行相關(guān)性分析，并在加性、顯性和隱性3種遺傳模型下對各SNP位點進行相關(guān)性分析。結(jié)果 rs3733402位點的基因型頻率在PTE病例組和健康對照組間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．041)，KLKB1基因區(qū)域rs2292423、rs4253325和rs3733402 3個位點組成的GTG單倍型分布在PTE組和健康對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．040)。結(jié)論 漢族人群KLKB1基因區(qū)域中的rs3733402位點與PTE的遺傳易感性相關(guān)。

單核苷酸多態(tài)性;肺血栓栓塞癥;KLKB1;血漿前激肽釋放酶

Acta Acad Med Sin，2015，37(3):274-278

靜脈血栓栓塞癥包括肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)和深靜脈血栓形成(deep vein thromboembolism，DVT)，是一種漏診率、誤診率、致殘率和致死率都非常高的疾病，嚴重危害人類健康。肺血栓栓塞主要指來自右心或靜脈系統(tǒng)的血栓阻塞血管導(dǎo)致的一種病理狀態(tài)，目前我國缺乏PTE詳盡的流行病學(xué)資料。近年來，隨著臨床對該疾病關(guān)注的增加，研究人員發(fā)現(xiàn)，除了繼發(fā)因素外，遺傳背景的差異也是PTE易感的主要原因之一，所以從分子遺傳的角度去解釋PTE易感性以及從分子水平對PTE的發(fā)病機制進行研究，將對PTE的早期預(yù)防、臨床診斷與治療有著不容忽視的作用。研究顯示，KLKB1基因是PTE的重要候選基因之一［1-2］，KLKB1編碼的血漿前激肽釋放酶(plasma prekallikrein，PPK)是血漿激肽釋放酶(plasma kallikrein，PK)的前體，也是一種絲氨酸蛋白酶，與十一因子(factorⅪ，F(xiàn)Ⅺ)有58%的同源相似性［3］。十二因子(factorⅫ，F(xiàn)Ⅻ)可將PPK轉(zhuǎn)換為PK，高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HMWK)在這個過程中作為輔因子。PK又可以激活FⅫ，放大活化級聯(lián)反應(yīng)，兩者聯(lián)合將纖溶酶原激活為纖溶酶，從而與纖溶系統(tǒng)相聯(lián)系［4-6］。研究證實，KLKB1基因多態(tài)性與糖尿病，高血壓等多種疾病相關(guān)［7］，但其與PTE的相關(guān)性研究較少，尤其缺乏中國人群的數(shù)據(jù)支持。本研究基于前期對KLKB1基因高通量測序數(shù)據(jù)所提示的3個常見單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)變異，在PTE患者及正常人群中進行了相關(guān)分析，探討了KLKB1基因和PTE的關(guān)系，以期為PTE的防治提供可能的參考。

對象和方法

對象 2008年11月至2012年3月北京醫(yī)院及北京朝陽醫(yī)院呼吸科確診的PTE患者95例(PTE病例組)，其中，男44例，女51例，平均年齡(53．8± 16．2)歲(34～68歲)，所有病例均來自無血緣關(guān)系的漢族人群，嚴格參照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會2001年制定的《肺血栓栓塞癥診斷和治療指南(草案)》［8］，經(jīng)過核素肺灌注顯像和/或螺旋CT、電子束CT或MRI及肺動脈造影發(fā)現(xiàn)管腔充盈缺損而確診。同期在北京醫(yī)院體檢中心體檢的健康體檢者90人(對照組)，其中，男 45人，女 45人，平均年齡(50．2±13．6)歲(31～69歲)，對照組的性別、年齡與PTE病例組匹配，既往均無心腦血管，血液，內(nèi)分泌，肝、腎疾病，且無深靜脈血栓、PTE病史。兩組受試者均符合人體試驗倫理學(xué)標準。本研究獲北京醫(yī)院倫理委員會批準(2012BJYYEC-054-01)，所有受試者均簽署知情同意書。

基因組DNA提取及基因分型方法 所有受試者均空腹采取靜脈血0．5 ml，用博爾誠全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，經(jīng)Nanodrop 2000定量，并經(jīng)瓊脂糖電泳質(zhì)檢合格后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

rs2292423、rs3733402和rs4253325 3個位點的信息來自前期新一代高通量測序(next-generation highthroughput DNA sequencing，NGS)篩選結(jié)果，經(jīng)過樣本量和統(tǒng)計學(xué)效能的計算原則，挑選KLKB1基因區(qū)段中次要等位基因頻率(minor allele frequence，MAF) ＞0．05的3個常見SNP位點，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)-Sanger法擴大樣本量進行后續(xù)分型驗證。參照UCSC(refseq GRCH37．p13)數(shù)據(jù)庫選取KLKB1基因3個SNP位點對應(yīng)的目標區(qū)域:用Primer3軟件分別設(shè)計擴增引物:F1(5’-CTGCCGCTATTGGTGATGAA-3’)，R1(5’-AGGGGAAGCCTAGGAGAGAA-3’);F2(5’-TCTTGTACAGCTTGCCATCG-3’)，R2(5’-ATGTTTGCGTGGCATATGAA-3’); F3(5’-GGTTACTCACAGGTGAAATCCA-3’)，R3(5’-TTCTCAAGCAGCCTATTGTGTT-3’)。PCR反應(yīng)體系為:模板DNA各1 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl)0．5 μl，含dNTP混合物 4 μl(各2．5 mmol/L)，前后引物(100 pmol/μl)各0．25 μl，雙蒸水39 μl。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次;72℃后延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2．0%瓊脂糖電泳后，使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收目的條帶，送擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行Sanger法測序。采用凝膠成像儀分析其基因型及等位基因。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用 PLINK 1．07(http://pngu．mgh．harvard．edu/～purcell/plink/)軟件分析基因分型結(jié)果，首先在對照組中檢驗所有SNP位點是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，然后對符合Hardy-Weinberg平衡定律的SNP位點基因型和等位基因進行分析，采用χ2檢驗比較各SNP位點等位基因頻率和基因型頻率的組間差異，計算 χ2值、OR、雙側(cè)95置信區(qū)間(95%CI)和P值，在各遺傳模型(加性模型、顯性模型、隱性模型)下采用Logistic回歸對各SNP位點進行分析，以Bonferroni校正后的P值(Pa=P×3) ＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。單倍體型采用Haploview v4．2軟件進行分析，計算χ2值和P值。

結(jié)果

Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果及SNP關(guān)聯(lián)分析結(jié)果 Hardy-Weinberg平衡檢測結(jié)果顯示，rs2292423(P=0．736及P=0．999)、rs3733402(P=0．837及P=0．968)和rs4253325(P=0．818及P=0．274)3個位點在對照組及PTE病例組中均符合Hardy-Weinberg平衡(表1)。KLKB1基因區(qū)域的rs3733402位點基因型頻率在PTE病例組和對照組間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4．162，P=0．041)。該位點有3個基因型，分別是野生型AA基因型、雜合型AG基因型和純合子突變型GG基因型，這3種基因型在PTE病例分布中存在差異。rs2292423(χ2=2．879，P=0．0898)和 rs4253325位點(χ2=0．066，P= 0．798)的基因型頻率在PTE病例組和對照組間的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，在加性模型、顯性模型和隱性模型下，經(jīng)過Bonferroni校正校正后，rs2292423、rs4253325和rs3733402 3個位點的基因型頻率在PTE病例組和對照組間的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0．05)(表2)。

連鎖不平衡分析和單倍型分析結(jié)果 KLKB1基因區(qū)域rs2292423、rs4253325和rs3733402 3個位點組成的GTG單倍型分布頻率在對照組和PTE病例組中分別為29．8%和40．0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4．22，P=0．040);AAG單倍型分布頻率在對照組和PTE病例組中分別為34．3%和32．6%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0．11，P=0．739);ATA單倍型分布頻率在對照組和PTE病例組中分別為34．8%和26．8%，差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2．76，P=0．097)。

表1 各SNP位點基因型和等位基因頻率在PTE病例組和對照組中的分析［n(%)］Table 1 Analysis of genotype and allele frequencies of the three SNP sites in PTE group and control group［n(%)］

討論

KLKB1基因區(qū)域位于染色體4q35上，其編碼的PPK水解后可生成PK［9］，而PK主要的兩種作用底物是凝血因子Ⅻ和HMWK［10］。當(dāng)血液與帶負電荷的膠原蛋白(皮膚血管外壁)接觸時，凝血因子Ⅻ就轉(zhuǎn)化成凝血因子Ⅻa，后者除了能激活凝血因子Ⅺ外，又可同時激活PK，激活的PK在HMWK促進下又進一步使得凝血因子Ⅻ激活。由此內(nèi)源性凝血途徑被激發(fā)，被放大，最終導(dǎo)致纖維蛋白的產(chǎn)生和血栓形成［11］。而HMWK水解會釋放緩激肽(bradykinin，BK)，這種物質(zhì)被認為在調(diào)控炎癥、血管功能、血壓功能和疼痛反應(yīng)的血漿激肽釋放酶激肽系統(tǒng)(plasma kallikreinkinin system，KKS)中有著不容忽視的作用［12-13］。

表2 不同遺傳模型下個SNP位點的分析Table 2 Analysis of SNP loci in different genetic models

基因多態(tài)性是指在一個生物群體中，同時和經(jīng)常存在兩種或多種不連續(xù)的變異型或基因型或等位基因，也被稱為遺傳多態(tài)性。基于人類基因組計劃的研究結(jié)果，不同個體的DNA序列僅存在0．1%的差異，這些差異90%是SNP，即單個核苷酸轉(zhuǎn)換、插入或缺失而形成的基因多態(tài)性。SNP是研究人類家族遺傳變異的重要依據(jù)，一般認為DNA序列中某特定位點的變異頻率低于1%為突變，高于1%為分子多態(tài)性。研究候選基因的SNPs及單倍體型能為PTE的臨床診療提供一定的指導(dǎo)，盡管國內(nèi)、外相繼報道了與PTE相關(guān)的SNPs，但由于信息零散且不系統(tǒng)，以及人種、生活習(xí)慣、環(huán)境因素等的差異，目前所報道的PTE相關(guān)SNPs并不能為中國臨床診治提供有價值的參考。

在KLKB1基因3個常見變異中，rs2292423為4號染色體上內(nèi)含子187158034處由A突變G，rs3733402 和rs4253325分別為 KLKB1基因區(qū)域187178473和187175722處發(fā)生錯義突變，rs3733402(A/G)編碼蛋白由絲氨酸(Ser)轉(zhuǎn)變成天冬酰胺(Asn)，而rs4253325(A/T)編碼蛋白由精氨酸(Arg)轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺(Gln)。本研究結(jié)果顯示，KLKB1基因外顯子區(qū)域rs3733402 G＞A與PTE相關(guān)，OR值提示其攜帶可能為PTE的危險因素，而rs3733402 G＞A錯義突變也導(dǎo)致Ser143Asn，由絲氨酸轉(zhuǎn)變成天冬氨酸的轉(zhuǎn)變涉及構(gòu)象的改變，故筆者推測可能會改變KLKB1編碼的PK功能改變，影響到凝血、纖溶系統(tǒng)中相應(yīng)成分的活化或滅活，從而促進血栓形成。本研究結(jié)果為接下來的研究提供了方向，今后本課題組將會深入分析KLKB1基因rs2292423該位點發(fā)生突變的產(chǎn)物與正常產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)進行對比，并對其在血液中的含量及下游產(chǎn)物的含量變化進行研究分析。

值得注意的是，PTE是一種多因素復(fù)雜性疾病，可能由多個功能系統(tǒng)間的平衡失調(diào)所致，所以多個基因的SNP及其特定組合可能是造成疾病易感性最重要的原因，也將是探究其發(fā)病機制，指導(dǎo)臨床診斷、藥物治療與預(yù)防最有效的方式之一，筆者在前期工作中也研究了血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)基因中rs1926723、rs699和rs476 3個SNP在PTE中的臨床意義［14］。但由于本研究中基因單一且樣本量較小，結(jié)論有一定局限性，在以后的實驗中需要著眼于更大樣本量的多基因聯(lián)合分析研究。同時，如若將盡可能多的相關(guān)基因放在一起，通過國家規(guī)范標準最后給出PTE發(fā)病風(fēng)險，并由醫(yī)療機構(gòu)提出進行相應(yīng)的預(yù)防措施，將會對未來PTE的診斷和個體化診療提供有意義的參考。

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Association between KLKB1 Polymorphisms and Pulmonary Thromboembolism

WANG Min-ne1，2，XU Xiao-mao3，ZHAI Zhen-guo4，SUN Liang5，F(xiàn)ANG Bao-min3，XIAO Fei5，GUO Jian5

1Graduate School，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China
2National Center for Clinical Laboratories，Beijing Hospital，Beijing 100730，China
3Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Beijing Hospital，Bejing 100730，China
4Beijing Key Laboratory of Respiratory and Pulmonary Circulation Disorders，Beijing Institute of Respiratory Medicine，Department of Respiratory Disease，Chaoyang Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100020，China
5Beijing Institute of Geriatric Medicine，Beijing Hospital，Beijing 100730，China

Objective To investigate the potential correlation between the single nucleotide polymorphisms(SNPs)in the KLKB1 region and pulmonary thromboembolism(PTE)in a Chinese Han population．Methods In this case-control study，95 patients with confirmed PTE were enrolled as the PTE group and 90healthy subjects as the control group．The genotypes，alleles，and haplotypes of the SNPs were analyzed with PLINK 1．07 and Haploview 4．2 software using chi-square test and Logistic regression analysis．SNPs were further analyzed under three genetic models(additive，dominant，and recessive)．Results The distribution of rs3733402 in KLKB1 gene showed significant difference between PTE group and control group(P=0．041)．The distributions of GTG haplotypes consisted of rs2292423，rs4253325，and rs3733402 in KLKB1 gene were also significantly different between PTE group and control group(P=0．040)．Conclusion The rs3733402 locus variation in KLKB1 gene is associated with PTE in Chinese Han people．

single nucleotide polymorphisms;pulmonary thromboembolism;KLKB1;plasma prekallikrein

GUO Jian Tel:010-85133860，E-mail:guojian@cma．org．cn

R563．5;R394;R341．2

A

1000-503X(2015)03-0274-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．03．005

2015-02-04)

郭 健 電話:010-85133860，電子郵件:guojian@cma．org．cn

國家自然科學(xué)基金(81170050)、北京市科技新星計劃(z121107002512058)、十二五科技支撐項目(2011BAI11B17)和衛(wèi)生行業(yè)科研專項項目(201302008)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81170050)，the Science and Technology Nova Plan of Beijing(z121107002512058)，the National Science＆Technology Pillar Program during the 12th Five-year Plan Period(2011BAI11B17)，and the National Department Public Benefit Research Foundation by Ministry of Health(201302008)