葉玉荷，胡芳華，鄒佳萍，湛 亞，王淑琪，劉姬艷

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州310036

淫羊藿苷在體內(nèi)外對(duì)血管生成的抑制作用

葉玉荷，胡芳華，鄒佳萍，湛 亞，王淑琪，劉姬艷

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州310036

目的 觀察淫羊藿苷(ICA)對(duì)血管生成的影響。方法 采用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ICA對(duì)CAM血管生成的影響，MTT法檢測(cè)ICA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)生長(zhǎng)的影響，流式細(xì)胞術(shù)分析ICA對(duì)HUVEC周期的影響，聚碳酸酯膜小室趨化運(yùn)動(dòng)模型檢測(cè)ICA對(duì)HUVEC細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果 ICA能明顯抑制CAM血管生成;抑制HUVEC生長(zhǎng)，其抑制效果與劑量和作用時(shí)間相關(guān);ICA作用下HUVEC細(xì)胞可出現(xiàn)周期阻滯，180 μg/ml ICA處理HUVEC 6 h對(duì)細(xì)胞遷移抑制率為78．0%。結(jié)論 ICA能抑制血管生成，但其體內(nèi)抑血管生成作用還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

淫羊藿苷;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株;雞胚絨毛尿囊膜;抗血管生成

Acta Acad Med Sin，2015，37(3):264-268

我國(guó)中醫(yī)藥治療與血管生成相關(guān)病癥有悠久的歷史［1］。一些中藥及其活性成分對(duì)腫瘤血管生成有良好的抑制作用［2］。淫羊藿又名仙靈脾、三枝九葉草、羊合葉等，系小蘗科淫羊藿屬植物，其味辛、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，藥用歷史悠久，療效確切，是臨床常用中藥［3］。淫羊藿苷(icariin，ICA)是從植物淫羊藿莖葉中提取的總黃酮的主要有效成分［4］。研究顯示，ICA對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制增殖、促凋亡作用［5-6］，能影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力［7］;ICA作用腫瘤后，細(xì)胞遷移速度和細(xì)胞的侵襲力也明顯降低［8］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮提取物對(duì)雞胚尿囊膜(chick chorioallantoic membrane，CAM)血管生成具有抑制作用［9］，而目前關(guān)于ICA抗血管生成的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在前期結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)觀察ICA抗血管生成的能力，研究其對(duì)血管生成的影響。

材料和方法

材料 受精雞蛋(品種:草三黃)購(gòu)自蕭山玉泉家禽有限公司，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vascular endothelial cell，HUVEC)購(gòu)自美國(guó) Sciencell公司，ICA由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)品鑒定所提供，Transwell培養(yǎng)小室為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品;MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物材料有限公司，人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) ELISA試劑盒購(gòu)自北京永輝生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide，DMSO)、伊紅、蘇木精、纖黏連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、Eukitt膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

CAM實(shí)驗(yàn) ICA用DMSO助溶，高糖DMEM培養(yǎng)液分別稀釋至400、200、100、50 μg/ml。雞胚模型的建立及實(shí)驗(yàn)操作［10］:選擇質(zhì)量相近 ［(50±5)g］的新鮮受精雞蛋在37．5℃、相對(duì)濕度65%～70%環(huán)境中孵育。取孵育7 d的雞胚，在超凈工作臺(tái)上在種蛋鈍端蛋氣室表面開(kāi)1個(gè)0．6 cm×1．0 cm窗，在凹痕處放入滅菌濾紙片，放置于近胚頭1 cm處兩條前卵黃靜脈之間的相對(duì)無(wú)血管區(qū)，加入藥液100 μl，連續(xù)給藥4 d。用透明膠紙封閉卵殼口，37．5℃孵育。4 d后取出雞胚，局部采用甲醛∶丙酮=1∶1常溫下固定20 min，待CAM上血管內(nèi)的血液完全凝固后，以濾紙片為中心剪下直徑為2 cm的尿囊膜，在顯微鏡下于濾紙區(qū)域內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)可見(jiàn)血管的分支點(diǎn)數(shù)目，計(jì)算血管生成抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。血管生成抑制率按照下式計(jì)算:抑制率(%)=(對(duì)照組總血管數(shù)-給藥組總血管數(shù))/對(duì)照組總血管數(shù)×100%。

HUVEC細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞以含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。以0．25% 胰蛋白酶消化細(xì)胞，2～3 d傳代1次，細(xì)胞傳代7次內(nèi)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

MTT實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl(含1．0×104細(xì)胞)。培養(yǎng)過(guò)夜后，加入不同濃度的用無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋的藥液10 μl，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入50 μl濃度為5 mg/ml的MTT液，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)5 h，每孔加入DMSO 150 μl，37℃、5%CO2放置過(guò)夜后，用Biorad酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔吸收值，調(diào)零孔則用高糖DMEM代替細(xì)胞懸液和藥液。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率按下列公式計(jì)算:細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組平均OD值-實(shí)驗(yàn)組平均OD值)/對(duì)照組平均OD值× 100%。

流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1．9 ml(含4×105細(xì)胞)。培養(yǎng)過(guò)夜后，加入不同濃度的藥液100 μl，對(duì)照組加入同體積的高糖DMEM液。作用不同時(shí)間后，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，體積分?jǐn)?shù)為0．70的乙醇-20℃固定24 h以上。離心洗去乙醇后加PI染色液，室溫下避光染色30 min。采用美國(guó)Coulter公司生產(chǎn)的EPICS XL型流式細(xì)胞儀，以氬離子激光器為激發(fā)光源，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，分析細(xì)胞DNA含量。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將8．0 μm孔徑的聚碳酸酯膜小室(Transwell)內(nèi)套管的上表面加10 μg/ml FN100 μl通風(fēng)櫥中風(fēng)干，PBS漂洗表面去除多余的結(jié)合蛋白。在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加入0．1%BSA-DMEM培養(yǎng)液，每孔600 μl。用0．25%胰酶(含0．02%EDTA)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，收集后懸浮于含0．1%BSA-DMEM培養(yǎng)液中，終濃度為1×106/ml。將含不同藥物濃度的細(xì)胞懸液加到Transwell小室中，每小室200 μl，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)液。將小室浸于24孔板的培養(yǎng)基中孵育6 h。將Transwell取出，濾膜用95%乙醇固定20 min。作HE染色。用棉簽擦去未遷移的濾膜表面的細(xì)胞，用Eukitt膠封片。顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，選取5個(gè)不同的視野，每組設(shè)3個(gè)平行樣。抑制率(%)=(對(duì)照組運(yùn)動(dòng)細(xì)胞數(shù)-給藥組運(yùn)動(dòng)細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組運(yùn)動(dòng)細(xì)胞數(shù)×100%。

VEGF濃度測(cè)定 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1．9 ml(含4×105細(xì)胞)。培養(yǎng)液選用低血清高糖DMEM液。培養(yǎng)過(guò)夜后，加入不同濃度的藥液100 μl，對(duì)照組加入同體積的高糖DMEM液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔取300 μl上清液，采用人VEGF ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)上清中的VEGF濃度［11］。嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行，用Biorad型酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處讀取OD值。所有樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均三復(fù)孔檢測(cè)，樣品VEGF濃度從VEGF標(biāo)準(zhǔn)曲線查得。

結(jié)果

ICA對(duì)CAM血管生成的影響 顯微鏡下陰性對(duì)照組血管網(wǎng)絡(luò)清晰，血管豐富且呈放射性生長(zhǎng)，生長(zhǎng)良好;ICA處理組血管數(shù)較對(duì)照組明顯減少，且血管多較細(xì)。400、200、100、50 μg/ml ICA處理組的CAM血管計(jì)數(shù)均較對(duì)照組明顯減少(P均＜0．05)。其中，400 μg/ml處理組的二級(jí)血管面積明顯減小，三級(jí)血管幾乎不生長(zhǎng)(表1、圖1)。

ICA對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的影響 200 μg/ml ICA作用于HUVEC細(xì)胞24、48、72 h時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為58．0%、71．3%、86．5%。與對(duì)照組(0 μg/ml)相比，各濃度ICA在各時(shí)間點(diǎn)均能明顯抑制HUVEC細(xì)胞增殖(P均＜0．05)，這種抑制作用與ICA的濃度和作用時(shí)間相關(guān)(表2)。

表1 ICA對(duì)CAM新生血管生成的影響(n=20)Table 1 Anti-angiogenesis effect of ICA on CAM(n=20)

圖1 ICA對(duì)CAM新生血管生成的影響(×40)Fig 1 Anti-angiogenesis effect of ICA on CAM(×40)

ICA對(duì)HUVEC細(xì)胞周期的影響 180 μg/ml ICA作用于HUVEC細(xì)胞12、24 h時(shí)，G0/G1期、S期細(xì)胞比例均顯著降低，G2/M期細(xì)胞比例均顯著增高，死亡細(xì)胞均迅速增加(P均＜0．05)(表3)。

ICA對(duì)HUVEC遷移能力的抑制作用 60、120、180 μg/ml ICA處理HUVEC細(xì)胞6 h后，HUVEC細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目分別為(129．3±5．1)、(73．6± 2．5)、(39．3±4．2)個(gè)，均明顯低于對(duì)照組的(178．7± 10．2)個(gè)(P均＜0．05)，其抑制率分別為27．6%、58．8%、78．0%。

ICA對(duì)HUVEC細(xì)胞VEGF分泌的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，60、120、180 μg/ml ICA處理48 h后，HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)上清中的VEGF含量分別為(578．67±20．53)、(494．67±9．45)、(457．67± 16．56)pg/ml，均明顯低于對(duì)照組的(637．67±10．07) pg/ml(P均＜0．05)。

表2 ICA對(duì)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(n=4，±s)Table 2 Inhibition of HUVEC cell proliferation by ICA(n=4，±s)

表2 ICA對(duì)HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(n=4，±s)Table 2 Inhibition of HUVEC cell proliferation by ICA(n=4，±s)

HUVEC:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;與0 μg/ml比較，aP＜0．05，bP＜0．01，cP＜0．001HUVEC:human umbilical vascular endothelial cell;aP＜0．05，bP＜0．01，cP＜0．001 compared with 0 μg/ml

濃度Concentration 24 h A 抑制率Inhibition ratio(%) 48 h A 抑制率Inhibition ratio(%) 72 h A 抑制率Inhibition ratio(%) 0 μg/ml 0．367±0．013 0．411±0．013 0．429±0．011 12．5 μg/ml 0．351±0．016a 4．4 0．375±0．006b 8．76 0．386±0．013b 10．0 25．0 μg/ml 0．342±0．021b 6．8 0．361±0．012b 12．20 0．347±0．020b 19．1 50．0 μg/ml 0．295±0．008c 19．6 0．308±0．011c 25．10 0．269±0．006c 37．3 100．0 μg/ml 0．274±0．018c 25．3 0．295±0．012c 28．20 0．217±0．012c 49．4 200．0 μg/ml 0．154±0．021c 58．0 0．118±0．009c 71．30 0．058±0．010c86．5

表3 180 μg/ml ICA處理HUVEC細(xì)胞不同時(shí)間的DNA含量(n=3，±s，%) Table 3 DNA content of HUVEC cells treated with 180 μg/ml ICA(n=3，±s，%)

表3 180 μg/ml ICA處理HUVEC細(xì)胞不同時(shí)間的DNA含量(n=3，±s，%) Table 3 DNA content of HUVEC cells treated with 180 μg/ml ICA(n=3，±s，%)

與對(duì)照組比較，aP＜0．05，bP＜0．01，cP＜0．001aP＜0．05，bP＜0．01，cP＜0．001 compared with control group

時(shí)間Time G0/G1 S G2/M 死亡細(xì)胞Death cell 6 h對(duì)照組Control group 27．20±0．32 51．55±0．98 21．25±1．75 2．40±0．45實(shí)驗(yàn)組Study group 7．82±1．32c 55．21±2．77 36．97±3．15a 5．84±1．82 12 h對(duì)照組Control group 33．35±0．71 47．19±0．63 19．46±1．05 2．88±0．21實(shí)驗(yàn)組Study group 8．35±1．16c 35．86±0．82b 55．79±1．78c 9．57±1．36b24 h對(duì)照組Control group 32．40±1．65 46．75±0．69 20．85±1．34 2．01±0．83實(shí)驗(yàn)組Study group 13．88±2．19c 29．63±3．54a 56．49±1．48b 24．54±1．47b

討論

目前應(yīng)用于臨床的抗腫瘤血管治療藥物數(shù)量少且價(jià)格昂貴，我國(guó)藥用植物資源豐富，基于傳統(tǒng)中藥的抗腫瘤血管藥物的篩選和開(kāi)發(fā)愈發(fā)得到關(guān)注。張妮娜等［12］觀察了中藥半枝蓮對(duì)血管生成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半枝蓮能可明顯抑制腫瘤血管生成，其機(jī)制可能與阻斷內(nèi)皮細(xì)胞遷移、下調(diào)VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)。胡靜等［13］通過(guò)觀察白頭翁醇提物對(duì)HUVEC增殖、遷移、凋亡以及小管形成和細(xì)胞周期的影響，認(rèn)為白頭翁醇提物在體外能有效抑制血管生成。Lee等［14］研究了從中藥蟾酥中提取的有效成分Bufalin對(duì)體外培養(yǎng)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 nmol/L Bufalin即可顯著抑制毛細(xì)血管生成，可見(jiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞阻滯于G2/M期，細(xì)胞增殖受到抑制。莫貴艷等［15］發(fā)現(xiàn)茶氨酸能影響HUVEC細(xì)胞增殖、凋亡和小管形成，在經(jīng)茶氨酸處理的肺腺癌裸鼠中，移植瘤新生血管被明顯抑制。Sohn等［16］用CAM實(shí)驗(yàn)研究了熊果酸的抗腫瘤血管生成作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熊果酸能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

CAM具有豐富的血管網(wǎng)，對(duì)抑制血管生成的藥物敏感，是一種較理想的研究影響血管生成因素或藥物篩選評(píng)價(jià)的體內(nèi)模型［17］。本研究結(jié)果顯示，ICA對(duì)CAM血管生成有明顯的抑制作用，且呈量效依賴關(guān)系。HUVEC是體外研究血管生成的常用細(xì)胞，本研究分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)觀察了ICA在體外對(duì)HUVEC細(xì)胞的影響，結(jié)果表明12．5 μg/ml ICA已顯示出對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖的抑制作用，并能將內(nèi)皮細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，阻止內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂。Transwell模型是觀察細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的三維培養(yǎng)方法［18］，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)180 μg/ml ICA處理6 h后，HUVEC細(xì)胞穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組顯著降低，抑制率可達(dá)78．0%。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，ICA對(duì)HUVEC細(xì)胞分泌的VEGF具有抑制作用。

綜上，本研究結(jié)果顯示，ICA對(duì)CAM血管生成具有明顯抑制作用，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中可發(fā)現(xiàn)明顯的抗血管生成效應(yīng)，即抑制HUVEC增殖，將其阻滯在G2/M期，并能抑制其遷移運(yùn)動(dòng)。但其體內(nèi)抑血管生成作用還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

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In Vivo and In Vitro Inhibitory Effects of Icariin on Angiogenesis

YE Yu-he，HU Fang-hua，ZOU Jia-ping，ZHAN Ya，WANG Shu-qi，LIU Ji-yan

School of Life and Environment Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China

Objective To investigate the inhibitory effects of icariin(ICA)，an active ingredient of Herb Epimedii，on angiogenesis．Methods The chick chorioallantoic membrane(CAM)assay was adopted to evaluate the effects of various doses of the ICA on the angiogenesis．The cell growth inhibitory effect of ICA on human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)was measured by MTT assay．Cell cycle arrest and the induction of apoptosis were evaluated by flow cytometry．The effect of ICA on the migration of HUVEC cells was measured on Transwell model．Results ICA remarkably inhibited angiogenesis in CAM in a concentration-dependent manner．The proliferation of HUVEC cells was inhibited by ICA，and the effect was time-and concentration-dependent．ICA-treated HUVEC cells showed cell cycle arrest;180 μg/ml of ICA decreased the percentage of migrating HUVEC cells by 78．0%．Conclusion ICA can effectively suppress angiogenesis;however，its in vivo inhibitory effect on angiogenesis warrants further investigations．

iariin;human umbilical vein endothelial cells;chick chorioallantoic;angiogenesis

LIU Ji-yan Tel:0571-81316321，E-mail:liujiyan_garce@163．com

R282．71

A

1000-503X(2015)03-0264-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．03．003

2014-12-15)

劉姬艷 電話:0571-81316321，電子郵件:liujiyan_garce@163．com

國(guó)家自然科學(xué)基金(81403280)、浙江省自然科學(xué)基金(LQ13H310005)和浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃(2014R421031) Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(81403280)，the Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LQ13H310005)，and the New-Shoot Talented Man Plan Project of Zhejiang Province(2014R421031)