牛哲禹，劉喬飛，王夢一，周 立，姚魯田，廖 泉，趙玉沛

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)院 北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京100730

葡萄糖調節(jié)蛋白78在小鼠胰腺癌發(fā)生演進過程中的表達變化

牛哲禹，劉喬飛，王夢一，周 立，姚魯田，廖 泉，趙玉沛

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)院 北京協(xié)和醫(yī)院基本外科，北京100730

目的 探討葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)在胰腺癌發(fā)生演進過程中的表達及意義。方法 通過二甲基苯并蒽(DMBA)胰腺原位包埋建立免疫健全C57BL/6J小鼠慢性胰腺炎、胰腺導管上皮內(nèi)瘤變(PanIN)及胰腺癌發(fā)生演進模型，采用免疫組織化學技術檢測GRP78在胰腺癌發(fā)生演進各階段的表達變化。結果 建立60例DMBA包埋模型，其中18例(30%)于觀察期間死亡，共獲得慢性胰腺炎9例(15%);PanIN 18例(30%)，包括PanINⅠ5例(8．3%)，PanINⅡ9 例(15%)，PanINⅢ4例(6．7%);胰腺癌15例(25%)。免疫組織化學結果顯示，胰腺癌組織中GRP78表達顯著高于癌旁正常導管細胞(χ2=13．39，P=0．000)，胰腺癌及高級別PanIN中的GRP78表達明顯高于低級別PanIN和慢性胰腺炎組織中的表達(χ2=17．84，P=0．000)。結論 GRP78的表達在胰腺癌各階段差異顯著，與胰腺癌的發(fā)生及演變相關。

胰腺癌;胰腺上皮內(nèi)瘤變;葡萄糖調節(jié)蛋白78

Acta Acad Med Sin，2015，37(3):259-263

胰腺癌是惡性程度最高的腫瘤之一，發(fā)病隱匿、進展迅速、手術切除率低、放化療效果不佳，預后極差，總體5年生存率大約為6%，在全球癌癥發(fā)病率占第13位，死亡率占第7位［1］。胰腺癌的早期預警及發(fā)生發(fā)展機制一直是國內(nèi)外研究的熱點，慢性胰腺炎和胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)被認為是胰腺導管上皮癌變的早期事件，反映了胰腺癌的發(fā)生和漸進演變［2］。

葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)又稱免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein，BIP)，為熱休克蛋白70家族的一員，位于細胞內(nèi)質網(wǎng)，是調節(jié)內(nèi)質網(wǎng)應激、啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)的重要分子。GRP78在內(nèi)質網(wǎng)中可促進蛋白質的正確折疊，維持內(nèi)質網(wǎng)正常功能，在細胞處于缺氧、低糖等應激狀態(tài)時，提高細胞的生存能力［3］。近期研究顯示，GRP78在胰腺癌中呈高表達，與患者的預后相關，但在胰腺癌發(fā)生及演進過程中的動態(tài)變化尚不清楚［4］。本研究通過二甲基苯并蔥(dimethylbenzanthracene，DMBA)原位埋入免疫健全C57BL/6J小鼠的胰腺實質建立慢性胰腺炎、PanIN及胰腺癌的發(fā)生演進模型，采用免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色技術檢測了GRP78在正常胰腺導管上皮、PanIN和胰腺癌中的表達變化，探討了PanIN 和GRP78與胰腺癌發(fā)生及演變的關系。

材料和方法

實驗動物和材料 4～6周齡雄性C57BL/6J小鼠60只，購于北京維通利華實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境。GRP78單抗購自英國Abcam公司，二步法染色試劑盒購自丹麥Dako公司，二抗及IHC試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。本研究動物實驗均通過中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院動物倫理委員會審查。

動物模型建立 小鼠術前禁食不禁水4 h，腹腔注射水合氯醛麻醉(10%，30 μl/10 g)，10%硫化鈉腹部脫毛后酒精消毒皮膚，取腹部正中切口長約3 cm，暴露胰腺，將遠端胰腺及脾臟輕柔拉出腹腔，細線在遠端胰腺預縫荷包，將DMBA(Sigma-Aldrich，USA)粉末(1 mg/25 g)植入荷包內(nèi)，拉緊縫線打結，還納腹腔，關腹前反復檢查，確保無DMBA泄漏入腹腔。所有存活小鼠均在術后2個月處死。

取材及病理學檢查 全部小鼠處死后解剖腹腔，觀察胰腺大小質地及腫瘤生長狀況，肝臟、脾臟、膽管、腸系膜轉移情況。剖開胸腔，觀察肺臟的轉移情況。取出全部胰腺、肝臟、肺臟置于10%福爾馬林溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅染色，病理科醫(yī)師光鏡下判斷病理學變化，診斷標準及PanIN技術和分級標準根據(jù)美國國立癌癥研究所于1999年制定的診斷標準［5］進行。

免疫組織化學染色檢測GRP78的表達 采用GRP78單抗(ab108613，Abcam，Cambridge，UK)和二步法染色試劑盒(EnVision+kit，Dako，Glostrup，Denmark)進行染色，具體為:石蠟包埋的組織制成4 μm的連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化;PBS沖洗去除內(nèi)源性過氧化物酶，置于煮沸的pH值6．0的枸櫞酸鹽緩沖液中高溫高壓修復抗原;PBS沖洗后，1∶100的一抗4℃孵育過夜。PBS沖洗后加入辣根酶標記的羊抗兔二抗100 μl，將切片放入恒溫箱37℃孵育1 h，PBS沖洗DAB顯色;用蘇木素將切片染色1 min，用水反復沖洗多次去除背景;分化返藍，沖洗后脫水、透明、封片，顯微鏡觀察并照相。陰性對照采用免疫前的兔血清。

結果判斷標準 光鏡下觀察，由2個觀察者分別進行評分，具體為:(1)根據(jù)染色強度將染色分為0～3分，陰性為0分，弱陽性為1分，中等陽性2分，強陽性為為3分;(2)根據(jù)視野內(nèi)陽性細胞比例將染色分為1～4分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，75%～100%為4分;(3)將(1)和(2)2項的得分相乘，最終得分取2個觀察者平均值，得分≤6分為低表達，＞6分為高表達。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18．0統(tǒng)計軟件包，GRP78表達強度差異采用卡方檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學定義。

結果

建模情況 60只小鼠中有18只(30%)于觀察期間死亡，其中2只體形消瘦，腹部膨隆，剖腹可見大量血性腹水，腹腔內(nèi)臟器廣泛黏連，胰腺部位腫瘤分別為1．3 cm和1．5 cm(長徑)，浸潤至小腸及腹壁，疑似DMBA泄露至腹腔所致。術后2個月處死所有剩余的42只小鼠，可見其胰腺變硬，腫脹，與周圍組織黏連，均伴有不同程度的腹水，未見肉眼可見肝臟及肺轉移。

HE染色結果 42只成功建模的小鼠中，慢性胰腺炎9例(15%);PanIN病變18例(30%)，其中，PanINⅠ5例(8．3%)，PanINⅡ9例(15%)，PanIN Ⅲ4例(6．7%);胰腺癌15例(25%)，其中，導管腺癌14例，胰腺纖維肉瘤1例。肝臟及肺臟均未檢出轉移癌。將PanINⅠ級定義為低級別胰腺上皮內(nèi)瘤變(L-PanIN)，共5例;Ⅱ級和Ⅲ級定為高級別胰腺上皮內(nèi)瘤變(H-PanIN)，共13例。

免疫組織化學染色結果 GRP78在癌旁組織、慢性胰腺炎和L-PanIN中主要為低表達，在H-PanIN和胰腺癌中主要為高表達(圖1、表1)。胰腺癌發(fā)展各階段的GRP78表達差異有統(tǒng)計學意義(χ2=22．23，P=0．000)，其中，GRP78在胰腺癌中的表達顯著高于癌旁組織(χ2=13．39，P=0．000)，在胰腺癌和H-PanIN中的表達顯著高于 L-PanIN和慢性胰腺炎(χ2=17．84，P=0．000)。

表1 GRP78在胰腺癌發(fā)生演進過程中的表達變化Table 1 Expression of GRP78 during the occurrence andprogression of pancreatic cancer neosplasia

圖1 GRP78在小鼠胰腺癌發(fā)生及演進各階段中的表達情況(免疫組織化學染色，×400)Fig 1 Expression of GRP78 in the occurrence and progression of the mouse pancreatic cancer(immunohistochemistry，×400)

討論

胰腺癌早期缺乏典型癥狀和有效的篩選指標，發(fā)現(xiàn)時往往已處于晚期，失去了手術機會。因此，胰腺癌的發(fā)生及演進過程是腫瘤研究的熱點，以期能篩選出提供早期預警的臨床病理學指標及分子標志物。以往研究表明，慢性胰腺炎和PanIN為胰腺癌癌前病變，是研究胰腺癌發(fā)生及演變的重要途徑［2］，但臨床中慢性胰腺炎及PanIN的標本獲取困難，限制了胰腺癌的炎癌轉化研究，因此設計胰腺癌及癌前病變的動物模型并利用其開展胰腺癌發(fā)生演變的研究具有重要的實際意義。以往研究顯示，利用SD大鼠DMBA包埋及Kras突變小鼠建立胰腺癌和PanIN模型耗時較長，花費較大［6-7］。將DMBA溶液注射入C57BL/6J小鼠胰腺遠端進行胰腺癌建模的成功率約為30%［8］，但小鼠胰腺體積小、薄，DMBA溶液流動性強，容易從針孔溢入腹腔，定量困難。本研究則采用藥物包埋的方法，有效解決了此問題，PanIN和胰腺癌建?？偝晒β蔬_到55%，模型的穩(wěn)定性大大增加。

GRP78是UPR最重要的伴侶蛋白，被認為是UPR激活的標記分子。當細胞處于缺氧、鈣離子失調、DNA損傷和毒性物質刺激時，內(nèi)質網(wǎng)中的未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白會發(fā)生累積，繼而誘發(fā)內(nèi)質網(wǎng)應激并通過UPR進行適應。本研究采用小鼠胰腺癌發(fā)生演進模型檢測了GRP78在慢性胰腺炎導管上皮細胞、PanIN及胰腺癌中的表達變化，結果顯示，隨著胰腺癌的發(fā)生及演進，GRP78表達具有明顯的規(guī)律性:在慢性胰腺炎和癌旁組織中大部分胰腺導管上皮細胞中GRP78呈低表達，說明在病變早期，胰腺導管上皮細胞內(nèi)質網(wǎng)應激初步呈現(xiàn)，細胞代謝異常不明顯。隨著癌前病變的進展，GRP78的表達顯著增高，高表達的比例在H-PanIN和胰腺癌中顯著增加，說明隨著胰腺病變的發(fā)生和進展，病變細胞中的內(nèi)質網(wǎng)應激相應加重，需要啟動UPR進行適應，進而保護細胞。這一發(fā)現(xiàn)與食管癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的相關文獻報道類似［9-11］，提示GRP78在多種腫瘤細胞的發(fā)生過程中均扮演了重要角色。以往研究也證實，實體腫瘤細胞的快速增殖可導致嚴重的內(nèi)質網(wǎng)應激，繼而通過GRP78表達啟動UPR，阻止細胞凋亡發(fā)生，起到保護細胞的作用。此外，惡性腫瘤的生長速度快于血管生成速度，其細胞處于缺血缺氧的狀態(tài)也會引起內(nèi)質網(wǎng)應激并誘導GRP78的過表達［12］。GRP78表達可直接反映細胞內(nèi)質網(wǎng)應激程度，并間接反映腫瘤細胞的生長速度，有望成為協(xié)助診斷及預后判斷的生物學標志物。在胃癌及肝細胞肝癌中的研究也證實，GRP78高表達與患者不良預后密切相關，肝癌細胞體外實驗顯示GRP78可通過增加黏著斑激酶的表達增強腫瘤轉移能力，敲低GRP78表達可顯著降低腫瘤細胞的增殖速度和異體移植瘤的生長［13-14］。

綜上，本研究結果顯示，GRP78的表達在胰腺癌發(fā)生及演變過程具有顯著的動態(tài)變化過程，其高表達可反映胰腺癌前病變的嚴重程度及胰腺癌的發(fā)生，進一步深入研究GRP78在人胰腺癌發(fā)生及演變中的分子作用機制并挖掘其臨床應用價值具有重要意義。

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Changes in the Expression of Glucose-regulated Protein 78 in the Occurrence and Progression of Pancreatic Cancer in Mouse Models

NIU Zhe-yu，LIU Qiao-fei，WANG Meng-yi，ZHOU Li，YAO Lu-tian，LIAO Quan，ZHAO Yu-pei

Department of General Surgery，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

Objective To investigate the changes in the expression of glucose-regulated protein 78(GRP78)in the occurrence and progression of pancreatic cancer in mouse models．Methods The mouse models of chronic pancreatitis，pancreatic intraepithelial neoplasia(PanIN)，and pancreatic cancer were successfully established by dimethyl benzene and anthracene(DMBA)embedding in situ．GRP78 expression was detected in various stages by immunohistochemistry．Results Of these 60 mouse models，18 mice(30%)died during the observation period．Two months after the embedding，the survived mice were sacrificed，and HE staining and IHC staining were performed．Among these mice，9(15%)developed chronic pancreatitis;18(30%)had PanIN［PanINⅠ，5(8．3%);PanINⅡ，9(15%);and PanINⅢ，4(6．7%)］;15(25%)developed pancreatic cancer．Immunohistochemistry showed that the expression of GRP78 in pancreatic cancer tissue wassignificantly higher than that in adjacent noncancerous duct cells(χ2=13．39，P=0．000)．Also，GRP78 expression in pancreatic cancer tissue and high grade PanIN was significantly higher than that in low grade PanIN and chronic pancreatitis(χ2=17．84，P=0．000)．Conclusion The expression of GRP78 remarkably differs in different stages of pancreatic cancer and therefore is associated with the occurrence and progression of this disease．

pancreatic cancer;pancreatic intraepithelial neoplasia;glucose-regulated protein 78

LIAO Quan Tel/Fax:010-69156007，E-mail:lqpumc@126．com; ZHAO Yu-peiTel:010-69156007，E-mail:zhao8028@263．net

R735．9

A

1000-503X(2015)03-0259-05

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．03．002

2014-12-15)

廖 泉 電話/傳真:010-69156007，電子郵件:lqpumc@126．com;趙玉沛 電話:010-69156007，電子郵件:zhao8028@263．net

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