劉 偉，劉 暢，陰 彬，彭小忠，3

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2人體解剖與組織胚胎學(xué)系 3神經(jīng)科學(xué)中心，北京100005

·論 著·

miR-9和miR-9*在SAMP8小鼠衰老中的功能及機(jī)制

劉 偉1，2，劉 暢1，陰 彬1，彭小忠1，3

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2人體解剖與組織胚胎學(xué)系3神經(jīng)科學(xué)中心，北京100005

目的 探討miR-9和miR-9*在SAMP8小鼠衰老中的功能及機(jī)制。方法 選取4-、8-、12-月齡快速老化傾向小鼠(SAMP8)作為研究對(duì)象，并以同月齡快速老化抵制小鼠(SAMR1)為對(duì)照，每組3只，取腦，切片進(jìn)行原位雜交檢測(cè)miR-9和miR-9*的表達(dá);分別以miR-9和miR-9*的模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲低miRNA對(duì)細(xì)胞周期的影響;生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-9和miR-9*靶基因并進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證。結(jié)果 miR-9 和miR-9*在SAMP8小鼠海馬區(qū)的表達(dá)低于SAMR1小鼠。敲低miR-9和miR-9*都可以增加N2a細(xì)胞G1期細(xì)胞在群體中的比例，減少S期細(xì)胞在群體中的比例，過(guò)表達(dá)則相反。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并通過(guò)文獻(xiàn)篩選miR-9的靶基因有PSEN1、SCN2B、MAP3K3和BACE1，miR-9*的靶基因有CDKn1c。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-9的靶基因是MAP3K3，miR-9*的靶基因是CDKn1c。結(jié)論 miR-9和miR-9*可能是分別通過(guò)其靶基因MAP3K3和CDKn1c在SAMP8小鼠衰老進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

miR-9;miR-9*;衰老;SAMP8小鼠;SAMR1小鼠;靶基因

Acta Acad Med Sin，2015，37(3):253-258

衰老是一個(gè)遺傳和環(huán)境因素相互作用的復(fù)雜過(guò)程，可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)某些疾病的易感性升高，喪失某些修復(fù)再生能力并逐漸虛弱［1］。對(duì)某些疾病表型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)證實(shí)，其致病因素與衰老有關(guān)［2］。microRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其在動(dòng)、植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控［3］。目前研究表明，miRNA在衰老過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Bonifacio等［4］檢測(cè)了衰老過(guò)程中成纖維細(xì)胞miRNA的表達(dá)，從中篩選出miR-143，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-143可以引起正常對(duì)照年輕的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。本課題組以往采用miRNA芯片對(duì)SAMP8小鼠和SAMR1小鼠的研究顯示，兩種小鼠海馬區(qū)miR-9和miR-9*的表達(dá)存在顯著差異［5］，本研究探討了miR-9和miR-9*在SAMP8小鼠衰老中的功能及機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性4-、8-、12-月齡SAMP8小鼠各3只，體重25～30 g;雄性4-、8-、12-月齡SAMR1小鼠各3只，體重25～30 g;均購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院老化鼠研究中心動(dòng)物房，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物房，室溫22～24℃，自由飲食，晝夜各12 h。

主要試劑 牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自瑞士Roche公司，miR-9和miR-9*LNA-修飾原位雜交探針由上海生工公司合成，Lipofectamin 2000、TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Vigfect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自北京威格拉斯公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

主要質(zhì)粒載體 pcDNA3．1:哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司，用于構(gòu)建報(bào)告基因以及miRNA的過(guò)表達(dá);pcDNA3．1-Luc:用于熒光素酶報(bào)告基因分析，由本實(shí)驗(yàn)室基于 pcDNA3．1改造;pcDNA3．1-GFP:用于miRNA對(duì)靶基因3’UTR的效應(yīng)分析，由本實(shí)驗(yàn)室基于pcDNA3．1改造。

原位雜交檢測(cè)miRNA表達(dá) 將小鼠用0．7%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，灌流取腦，4%PFA固定過(guò)夜，25%的蔗糖溶液脫水，O．C．T(Sakura，日本)包埋，Leica冰凍切片機(jī)切片(14 μm厚度)，常規(guī)原位雜交流程。切片于400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)視野，采用IPP6．0專業(yè)圖像分析軟件對(duì)各組圖片陽(yáng)性區(qū)域測(cè)定平均光密度值(mean optical density，MOD)進(jìn)行半定量分析。

流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 分別以miR-9和miR-9*的模擬物和抑制物及其相應(yīng)的陰性對(duì)照(對(duì)照組)轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，采用Real-time PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)和敲低效果。胰酶消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，70%預(yù)冷乙醇4℃固定12 h以上;用 PBS洗去乙醇，1500 r/min(r=5．5 cm)離心5 min;加入0．5 ml PCB作用5 min，PBS清洗;0．5 ml PBS重懸細(xì)胞，加入RNase A至終濃度50 μg/ml，37℃水浴30 min以上;加入PI至終濃度50 μg/ml，37℃染色10 min;采用流式細(xì)胞儀(CELL Quest，美國(guó)Becton-Dickinson)測(cè)定周期。

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)靶基因 通過(guò)www．targetscan．org 和www．microrna．org兩個(gè)網(wǎng)站對(duì)miR-9/miR-9*進(jìn)行了靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，結(jié)合文獻(xiàn)篩選與老化相關(guān)的基因。

熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將候選靶基因的3’UTR克隆到pcDNA3．1-Luc載體中，共轉(zhuǎn)染miR-9和miR-9*的模擬物或抑制物(吉瑪，中國(guó))、pcDNA3．1-Lucgene 3’UTR和pRL-TK入293ET細(xì)胞中，觀察熒光素酶活性變化。

Western blot法驗(yàn)證靶基因 將pcDNA3．1-GFPMAP3K3-3’UTR、miR-9模擬物和pcDNA3．1-GFP-CDKn1c-3’UTR、miR-9*的模擬物分別轉(zhuǎn)染293ET細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，收取蛋白，12%SDS-PAGE 膠70V電泳，半干法電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶封閉1 h，加小鼠單抗GFP(美國(guó)Abmart公司;1∶2000)，4℃過(guò)夜孵育。TBS-T將膜浸洗3次，羊抗小鼠二抗(北京中杉金橋，1∶5000)室溫孵育2 h;用TBS-T將膜浸洗3次，顯色。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2007統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

原位雜交結(jié)果 miR-9探針陽(yáng)性信號(hào)呈藍(lán)紫色顆粒狀，主要分布在海馬區(qū)域的大神經(jīng)元，在齒狀回顆粒細(xì)胞表達(dá)較海馬CA區(qū)錐體細(xì)胞高，SAMR1的染色深度略高于SAMP8小鼠(圖1A);IPP6．0半定量結(jié)果顯示，SAMR1的miR-9 MOD值明顯高于SAMP8(0．81± 0．03比0．34±0．02，P=0．04)。miR-9*的染色深度較miR-9高，在海馬CA區(qū)錐體細(xì)胞尤其是CA2、CA3表達(dá)較高，SAMR1的染色深度略深于SAMP8小鼠(圖1B);IPP6．0半定量結(jié)果顯示，SAMR1的miR-9*MOD值明顯高于SAMP8(0．74±0．04比0．40±0．01，P= 0．02)。

miR-9和miR-9*過(guò)表達(dá)和敲低對(duì)N2a細(xì)胞周期的影響 過(guò)表達(dá)或敲低miR-9和miR-9*的表達(dá)量與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0．01)(圖2A)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-9和miR-9*均可顯著減少N2a細(xì)胞G1期細(xì)胞在群體中的比例，增加S期細(xì)胞在群體中的比例(P＜0．05或P＜0．01)(圖2B);敲低miR-9和miR-9*時(shí)均可顯著增加N2a細(xì)胞G1期細(xì)胞在群體中的比例，減少S期細(xì)胞在群體中的比例(P均＜0．05)(圖2C)。

圖1 miR-9和miR-9*在4-，8-，12-月SAMR1及SAMP8小鼠中的表達(dá)情況(×40)Fig 1 Expression pattern of miR-9 and miR-9*in 4-，8-，and 12-month SAMR1 and SAMP8 mice(×40)

圖2 miR-9和miR-9*過(guò)表達(dá)和敲低對(duì)N2a細(xì)胞周期的影響Fig 2 Effects of miR-9/miR-9*overexpression and knock-down on cell cycle in N2a cells

miR-9和miR-9*的靶基因驗(yàn)證 靶基因生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合文獻(xiàn)篩選結(jié)果顯示，miR-9的候選靶基因?yàn)镻SEN1、SCN2B、MAP3K3和BACE1，miR-9*的候選靶基因?yàn)镃DKn1c。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-9后pcDNA3．1-Luc-MAP3K3-3’UTR的熒光素酶活性較對(duì)照組顯著降低(P＜0．05)，而PSEN1、SCN2B和BACE1-3’UTR與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0．05);敲低miR-9后，pcDNA3．1-Luc-MAP3K3-3’UTR熒光素酶活性有所回復(fù)。過(guò)表達(dá)miR-9*后pcDNA3．1-Luc-CDKn1c-3’UTR的熒光素酶活性也較對(duì)照組顯著降低(P＜0．01)，敲低miR-9*可導(dǎo)致熒光素酶活性顯著增高(P＜0．01)。Western blot驗(yàn)證miR-9和miR-9*的靶基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-9和miR-9*均可導(dǎo)致GFP蛋白表達(dá)降低(圖3)。

圖3 miR-9和miR-9*的靶基因驗(yàn)證Fig 3 Verification of the target genes of miR-9/miR-9*

討論

快速衰老小鼠是一種常用于老化相關(guān)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型，由日本京都大學(xué)在對(duì)AKR/J系小鼠進(jìn)行常規(guī)近交系培育時(shí)意外發(fā)現(xiàn)的，是國(guó)際上公認(rèn)的可用于老化研究的動(dòng)物模型［6］。海馬組織受衰老影響較大并且和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)，選取海馬部位觀察能夠較好地反映一個(gè)基因?qū)δX衰老的影響。目前臨床嘗試把miRNAs作為在血漿和腦脊液中診斷衰老相關(guān)疾病老年癡呆的分子標(biāo)志物，例如miR-146和miR-9在其中低表達(dá)［7］。而對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老模型的檢測(cè)則顯示，miR-146 和miR-9呈高表達(dá)［8］。Packer等［9］研究發(fā)現(xiàn)，miR-9/9*在亨廷頓氏病中低表達(dá)，可分別通過(guò)調(diào)控REST和coREST對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用。Schonrock等［10］采用Aβ處理神經(jīng)干細(xì)胞，結(jié)果顯示包括miR-9在內(nèi)的大部分miRNAs都有明顯下調(diào)。miR-9和miR-9*來(lái)自同一個(gè)pre-miRNA，本研究結(jié)果顯示它們?cè)诤ｑR組織中都有表達(dá)，且SAMR1的染色深度均略高于SAMP8，提示SAMP8小鼠海馬miR-9和miR-9*的表達(dá)較SAMR1降低。

已知衰老常伴隨細(xì)胞周期的改變。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了過(guò)表達(dá)和敲低miRNA對(duì)細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-9和miR-9*均可顯著減少N2a細(xì)胞G1期細(xì)胞在群體中的比例，增加S期細(xì)胞在群體中的比例，而敲低則相反，說(shuō)明過(guò)表達(dá)和敲低miR-9和miR-9*均可對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。

此外，本研究結(jié)合生物信息分析、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及Western blot檢測(cè)證實(shí)miR-9的靶基因是MAPK。MAPK是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，普遍存在于多種生物中(包括酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)，參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種生理反應(yīng)過(guò)程。MAPK的精細(xì)調(diào)控與阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥及多種癌癥相關(guān)［11］。本研究證實(shí)miR-9參與了MAPK的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，推測(cè)這可能也是其促進(jìn)SAMP8小鼠老化的原因之一。同樣，本研究亦證實(shí)miR-9*的靶基因是CDKn1c(又名p57，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑)，其在細(xì)胞周期的調(diào)控中能夠?qū)е翯1期阻滯，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有抑制作用。研究顯示，CDKn1c在腦發(fā)育過(guò)程中能夠促進(jìn)細(xì)胞的放射狀遷移和影響大腦皮層形成［12］。筆者推測(cè)，SAMP8小鼠腦中低表達(dá)的miR-9*會(huì)引起CDKn1c增高，進(jìn)而影響細(xì)胞周期，從而對(duì)小鼠海馬的發(fā)育及功能狀態(tài)產(chǎn)生影響，最終導(dǎo)致SAMP8小鼠出現(xiàn)快速老化。

綜上，本研究結(jié)果顯示，miR-9和miR-9*在SAMP8小鼠海馬中的表達(dá)均降低，兩者可能是分別通過(guò)其靶基因MAP3K3和CDKn1c在SAMP8小鼠衰老進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

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Functions of miR-9 and miR-9*during Aging in SAMP8 Mice and Their Possible Mechanisms

LIU Wei1，2，LIU Chang1，YIN Bin1，PENG Xiao-zhong1，3

1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Department of Molecular Biology and Biochemistry，
2Department of Human Anatomy，Histology and Embryology，3Neuroscience Center，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS and PUMC，Beijing 100005，China

Objective To explore the functions of miR-9 and miR-9*in SAMP8 mice during the aging and their possible mechanisms．Methods SAMP8 mice(4-，8-，12-month old，respectively)were selected，three age-matched SAMR1 mice were used as the control group with three mice in each group．The brains were collected and then sectioned for in situ hybridization of miR-9 and miR-9*．Mimics or inhibitors of miR-9 and miR-9*were transfected into N2a cells，and the effects of overexpression or knockdown of the microRNAs on the cell cycle were detected by flow cytometry．Target genes were predicted by bioinformatic analysis and confirmed by dual luciferase assay．Results Expressions of miR-9 and miR-9*in hippocampus of SAMP8 mice were lower than those of SAMR1 mice．Knockdown of miR-9 and miR-9*induced a prolonged G1 phase and a shortened Sphase in N2a cells;in contrast，miR-9 and miR-9*overexpression showed opposite effects．The predicted target genes of miR-9 were PSEN1，SCN2B，MAP3K3，and BACE1，and that of miR-9*was CDKn1c．Dual luciferase reporter gene assay showed that miR-9 targeted MAP3K3 while miR-9*targeted CDKn1c．Conclusion miR-9 and miR-9*play an important role during aging via the target genes MAP3K3 and CDKn1c in the SAMP8 mice．

miR-9;miR-9*;ageing;SAMP8 mice;SAMR1 mice;target gene

PENG Xiao-zhong Tel:010-69156434，E-mail:peng_xiaozhong@163．com

R34

A

1000-503X(2015)03-0253-06

10．3881/j．issn．1000-503X．2015．03．001

2015-02-13)

彭小忠 電話:010-69156434，電子郵件:peng_xiaozhong@163．com

重大科學(xué)研究計(jì)劃(2011CBA01104)Supported by the Key Scientific Research Project(2011CBA01104)