趙杰，王華榮，步建衡，左敏，張國忠

（1.河北省公安廳物證鑒定中心，河北石家莊 050000；2.滄州市公安局刑事科學技術研究所，河北滄州 061000；3.河北醫(yī)科大學法醫(yī)學系，河北石家莊 050051）

大鼠雙后肢擠壓傷后肺、肝細胞的凋亡

趙杰1，王華榮2，步建衡1，左敏3，張國忠3

（1.河北省公安廳物證鑒定中心，河北石家莊 050000；2.滄州市公安局刑事科學技術研究所，河北滄州 061000；3.河北醫(yī)科大學法醫(yī)學系，河北石家莊 050051）

目的研究大鼠雙后肢擠壓傷后肺、肝細胞的凋亡過程，探討擠壓傷損傷機制。方法建立大鼠雙后肢擠壓傷模型，采用TUNEL法對大鼠肺、肝細胞凋亡進行檢測，免疫組織化學法檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3的表達。結果與對照組相比，損傷組大鼠雙后肢局部肌肉組織明顯損傷，肺、肝細胞凋亡明顯增多（P〈0.05），凋亡相關蛋白Bax上調(diào)、Bcl-2下調(diào)、caspase-3被激活（P〈0.05）。結論大鼠雙后肢擠壓傷后引起肺、肝細胞凋亡明顯增多，可能是損傷釋放的相關因子介導了細胞凋亡的發(fā)生。

法醫(yī)病理學；創(chuàng)傷和損傷；擠壓；細胞凋亡；Bax；Bcl-2；caspase-3；大鼠

廣泛軟組織損傷在法醫(yī)學實踐中較為常見，多見于打架斗毆、刑訊逼供、虐待等，也可見于交通事故、地震和工礦塌方等意外事故。一般損傷集中于臀部、雙下肢以及背部等肌肉軟組織豐富的部位，其損傷特點是局部損傷貌似輕微，全身性繼發(fā)性病理變化隱匿，后果嚴重，可引起器官的嚴重損害，直至創(chuàng)傷性多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。MODS是創(chuàng)傷患者嚴重并發(fā)癥之一，病情進展快，死亡率高。在MODS的發(fā)病過程中，不僅是缺血-再灌注，過度炎癥及內(nèi)毒素攻擊能直接引起細胞受損——“他殺”而死，同時也有基因調(diào)控的“自殺”而死，即細胞凋亡的過程[1]。嚴重創(chuàng)傷后，機體內(nèi)各器官中普遍發(fā)生了細胞凋亡，而且這種凋亡往往發(fā)生的時間很早，而壞死則主要在后期發(fā)生；也就是說，細胞凋亡不僅參與了MODS，而且還可能在MODS的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。本實驗通過建立大鼠雙后肢擠壓傷模型，用原位末端標記（TUNEL）法和免疫組織化學法分別檢測肺和肝細胞凋亡變化以及Bax、Bcl-2、caspase-3凋亡相關蛋白的表達，探討擠壓傷損傷機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TUNEL試劑盒（德國寶靈曼公司），兔抗鼠Bax多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體（丹麥Dako公司），caspase-3試劑盒（美國Zymed公司），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 模型建立

健康Wistar大鼠40只，體質(zhì)量（160±20）g，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，隨機分為損傷組和對照組，每組20只。實驗前大鼠禁食12h，自由飲水。損傷組大鼠用45mg/kg 5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，俯臥位固定于鼠臺上，于雙后肢上壓15kg標準重物，持續(xù)擠壓5h，然后解除擠壓，使其自由活動，繼續(xù)觀察5h。對照組大鼠除不擠壓外，其余處理與損傷組相同。

1.3 取材及處理

將大鼠用5%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉后，沿腹中線分層切開腹壁，大鼠經(jīng)腹主動脈快速放血處死，提取受壓肢體肌肉組織、肺及肝組織適量，用10%中性甲醛溶液固定。

1.4 指標檢測

1.4.1 病理學觀察

觀察受壓肢體的大體病理學變化，并取受壓肢體肌肉組織、部分肺組織和肝組織常規(guī)制作石蠟切片、HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.4.2 TUNEL法檢測細胞凋亡

參照試劑盒操作指南進行。石蠟切片厚5μm，脫蠟至水，蒸餾水洗，磷酸緩沖液（PBST）洗3次，2%蛋白酶K 37℃，孵育30min，雙蒸水（DDW）洗3次，孵育3 min，DDW洗3次，3%H2O2孵育10 min，DDW 洗3次，加標記緩沖液，室溫放15min，加入等量的用標記緩沖液配制的TdT和Bio-dUTP，37℃孵育1 h，將標本在2×SSC中浸泡15min（室溫），PBST洗3次，加封閉液，室溫封閉30 min，加入用封閉液稀釋（1∶50）的Avidin-HRP，37℃孵育1h，DAB顯色，常規(guī)復染，封片，顯微鏡下計數(shù)細胞核呈棕黃色凋亡陽性細胞數(shù)，并拍照。TUNEL法計算細胞凋亡率：每組觀察4張切片，計數(shù)100個細胞內(nèi)的陽性細胞數(shù)，以百分數(shù)表示凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.4.3 免疫組織化學法檢測凋亡相關蛋白表達

采用免疫組織化學法（SP法）檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3的表達。石蠟切片梯度乙醇脫蠟至水，Bax、Bcl-2、caspase-3一抗稀釋比分別為1∶50、1∶100、1∶100。

分析Bax、Bcl-2、caspase-3表達的免疫組織化學圖像，固定電壓，固定入射光強度，HPIAS-1000高清晰度彩色病理系統(tǒng)（南京紅綠藍智能系統(tǒng)有限公司）隨機選取4個視野，計數(shù)200個細胞，測量各組陽性細胞的光密度值，取均值后進行統(tǒng)計學檢驗。

1.4.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，組間差異用t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 病理學觀察結果

損傷組大鼠被切開雙后肢肌肉組織時可見多量粉紅色液體從切面溢出，鏡下觀察肌纖維明顯腫脹，橫紋不清，部分肌纖維溶解，小血管明顯淤血，間質(zhì)出血、水腫。對照組肌纖維結構清楚，未見明顯異常改變。

損傷組大鼠肺、肝組織呈輕度充血表現(xiàn)，血管內(nèi)中性白細胞聚集，間質(zhì)水腫、出血，彌散性血管內(nèi)凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）形成，實質(zhì)細胞顆粒變性，肺組織可見散在核固縮細胞，肝小葉中央帶核固縮細胞增多。對照組未見明顯異常改變。

2.2 肺、肝細胞凋亡

凋亡細胞在肺組織主要分布于支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細胞，在肝組織主要分布于血管內(nèi)皮細胞（圖1），對照組AI明顯低于損傷組（表1，P〈0.05）。

表1 兩組大鼠肺、肝細胞AI比較（n=20，±s，%）

表1 兩組大鼠肺、肝細胞AI比較（n=20，±s，%）

組別肺肝對照4.40±0.154.22±0.37損傷13.19±0.161）14.31±0.161）

2.3 肺、肝細胞Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白的表達

損傷組Bax蛋白陽性表達在肺組織主要分布于肺支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細胞，在肝組織主要分布于血管內(nèi)皮細胞（圖2）。對照組陽性表達低于損傷組（表2，P〈0.05）。

圖2 大鼠肺、肝Bax免疫組織化學染色SP×100

表2 大鼠肺、肝細胞凋亡相關蛋白的光密度值（n=20，±s）

表2 大鼠肺、肝細胞凋亡相關蛋白的光密度值（n=20，±s）

注：1）與對照組比較，P〈0.05

蛋白組別肺肝Bax對照1.69±0.400.56±0.08損傷3.64±0.211）3.18±0.251）Bcl-2對照4.68±0.384.77±0.25損傷2.64±0.281）2.27±0.291）caspase-3對照2.31±0.082.25±0.11損傷4.47±0.171）4.49±0.171）

損傷組Bcl-2蛋白陽性表達在肺組織主要分布于支氣管黏膜、肺血管內(nèi)皮細胞，在肝組織主要分布于微血管及血管內(nèi)皮細胞（圖3）。對照組陽性表達高于損傷組（表2，P〈0.05）。

損傷組caspase-3蛋白陽性表達在肺組織主要分布于支氣管黏膜、肺血管內(nèi)皮細胞，在肝組織主要分布于血管內(nèi)皮細胞（圖4）。對照組陽性表達低于損傷組（表2，P〈0.05）。

圖3 大鼠肺、肝Bcl-2免疫組織化學染色SP×100

圖4 大鼠肺、肝caspase-3免疫組織化學染色SP×100

3 討論

傳統(tǒng)的觀點認為，在嚴重損傷和休克等急性損傷時，機體組織、細胞因缺血、缺氧等引發(fā)壞死。近年來，隨著對細胞凋亡認識的深入，許多學者注意到細胞凋亡與MODS的發(fā)生發(fā)展關系密切，在嚴重創(chuàng)傷后，機體內(nèi)各器官中普遍發(fā)生了細胞凋亡，細胞凋亡不僅參與了MODS，而且在其發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色[2]。陸江陽等[3]通過動物實驗觀察到MODS早期免疫器官細胞凋亡增多的現(xiàn)象。

3.1 大鼠雙后肢擠壓傷模型的建立

本實驗通過應用相當于大鼠體質(zhì)量約100倍的重物擠壓大鼠雙后肢導致受壓局部肌肉嚴重損傷。持續(xù)擠壓5h，然后解除擠壓、釋放大鼠，使其自由活動，又連續(xù)觀察了5h后處死大鼠，這為觀察擠壓傷后早期肌肉組織損傷提供了充足的時間[4]。實驗結果顯示，大鼠肢體擠壓解除后逐漸腫脹、青紫，肌纖維溶解，血管擴張、淤血、出血、間質(zhì)水腫等繼發(fā)性損傷。表明擠壓大鼠雙后肢不僅導致受壓局部肌肉損傷，還造成了更嚴重的繼發(fā)性損傷。

3.2 擠壓傷導致肺和肝細胞凋亡的增多

本實驗采用TUNEL法，檢測到損傷組大鼠肺、肝等遠隔器官的AI明顯高于對照組，肺組織細胞凋亡主要分布在肺部支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細胞，肝細胞凋亡主要分布在血管內(nèi)皮細胞。結果說明，大鼠雙下肢受到擠壓后引起遠隔器官肺和肝凋亡細胞的增多，提示擠壓作為一個體外因素觸發(fā)了凋亡程序而引起了遠隔器官肺和肝細胞凋亡的增加。

3.3 凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3參與了細胞凋亡

細胞凋亡是一個程序化的過程，是級聯(lián)式基因表達的結果，能影響細胞凋亡的因素很多，當細胞受到凋亡誘導因素作用后，經(jīng)有關信號傳導系統(tǒng)傳遞而激活凋亡相關基因，細胞即執(zhí)行死亡程序一步步走向死亡。在與細胞凋亡相關的眾多基因中，Bcl-2是第一個被確定的抑制細胞凋亡的基因，Bcl-2可以通過抑制促凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax的細胞毒作用而阻抑多種凋亡誘導因素所引發(fā)的細胞凋亡[5]。caspase-3被認為是在多種誘導劑刺激后導致蛋白酶級聯(lián)反應的關鍵酶，其活化預示著細胞凋亡執(zhí)行階段的開始。Bcl-2也可以通過抑制caspase-3的激活而發(fā)揮其抗細胞凋亡作用[6]。

本實驗通過用免疫組織化學圖像分析方法觀察了Bax、Bcl-2和caspase-3表達的變化，實驗發(fā)現(xiàn)，Bax蛋白陽性表達在肺部主要分布于支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細胞，損傷組陽性表達強度明顯高于對照組，在肝主要分布于血管內(nèi)皮細胞。而Bcl-2蛋白陽性表達在肺部也主要分布于支氣管黏膜和肺血管內(nèi)皮細胞，損傷組陽性表達強度明顯低于對照組，在肝主要分布于微血管及血管內(nèi)皮細胞，Bax、Bcl-2蛋白的表達情況在肺部相同。實驗還發(fā)現(xiàn)，擠壓傷后肺及肝細胞的caspase-3表達明顯高于對照組。損傷組遠隔器官肺、肝細胞Bax的上調(diào)、Bcl-2的下調(diào)以及caspase-3被激活，說明隨著擠壓的持續(xù)作用，肺、肝細胞的凋亡在加重，caspase-3參與介導了遠隔器官肺、肝的細胞凋亡。

3.4 擠壓傷導致遠隔器官細胞凋亡的發(fā)生機理

MODS的常見原因有創(chuàng)傷、感染、中毒等，Nuytinck 等[7]提出了創(chuàng)傷致MODS發(fā)生的全身炎癥介質(zhì)作用機理。本實驗可能是在擠壓大鼠雙下肢后，局部創(chuàng)傷組織釋放出壞死分解產(chǎn)物等成分，激活效應細胞釋放大量炎癥介質(zhì)，導致遠隔器官損傷。遠隔器官細胞凋亡的發(fā)生可能與組織缺血缺氧、再灌注過程中氧自由基的作用，以及TNF、NO等炎癥介質(zhì)有關[8-9]。本研究證實，上述有害因子誘導細胞凋亡的機理可能與p53介導的Bax上調(diào)和Bcl-2下調(diào)途徑以及caspase-3的激活有關。

綜上所述，擠壓大鼠雙后肢可以引起遠隔器官肺、肝細胞的凋亡，凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3的表達參與了細胞凋亡的過程。至于擠壓大鼠雙后肢引起遠隔器官肺、肝細胞凋亡的過程是由哪些蛋白和（或）因子介導的，還需要進一步研究證實。

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Apoptosis in Lungs and Liver after Crush Injury of Hindlimbs in Rat

ZHAO Jie1,WANG Hua-rong2,BU Jian-heng1,ZUO Min3,ZHANG Guo-zhong3
（1.Center of Evidence Identification,Public Security Department of Hebei Province,Shijiazhuang 050000, China;2.Criminal Investigation Team,Cangzhou Public Security Bureau,Cangzhou 061000,China;3.School of Forensic Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050051,China）

Objective To investigate the process of apoptosis in lungs and liver induced by crushing hindlimbs of rat,and study the mechanism of crush injury.Methods The rat experimental model of hindlimbs crush injury was established.The cell apoptosis in lungs and liver was detected by TUNEL assay,and the expression of Bax,Bcl-2 and caspase-3 apoptin was examined by immunohistochemistry. Results Compared with the control group,the partial muscle injury of rat's hindlimbs was more serious with more apoptosis observed in lungs and liver（P＜0.05）.The expression of Bax was up-regulated and Bcl-2 was down-regulated,whereas caspase-3 expression was activated（P＜0.05）.Conclusion The cell apoptosis has increased significantly in lungs and liver after crush injury of hindlimbs in rat.The correlation factor released during tissue injury may mediate apoptosis process.

forensic pathology;wounds and injuries;crush;apoptosis;Bax;Bcl-2;caspase-3;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.02.003

1004-5619（2015）02-0088-05

2013-11-07）

（本文編輯：張建華）

趙杰（1983—），男，山西介休人，碩士，主要從事法

醫(yī)病理學工作和研究；E-mail：zhaojie142433＠sina.com