李勝民，王軍

（北京市醫(yī)療器械檢驗所、醫(yī)療器械檢驗與安全性評價北京市重點實驗室，北京 101111）

人體血清中總鈣含量的高低是人體健康狀況的重要指標(biāo)，其與人體的多種疾病密切相關(guān)［1–5］。目前測定血清中鈣的常規(guī)方法很多，不同方法的檢測結(jié)果差異很大。醫(yī)學(xué)實驗室通常自建參考方法，通過參加實驗室間的量值比對保證不同實驗室檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

同位素稀釋質(zhì)譜法是國際公認(rèn)的權(quán)威測量方法［6］，同位素稀釋質(zhì)譜法通常需要用多接收ICP–MS先測定濃縮同位素的豐度比值，并計算濃縮同位素的濃度［7–10］，而多接收ICP–MS儀器價格高昂，普通實驗室無力購置。

筆者在LGC同位素稀釋法原理［11–13］基礎(chǔ)上建立了反應(yīng)池–兩步同位素稀釋質(zhì)譜法測定血清總鈣的參考方法。與常規(guī)同位素稀釋法相比，該方法的優(yōu)點在于定值過程中不必先標(biāo)定濃縮同位素的濃度，僅通過測定選定的一對同位素豐度比值，即可測定血清中鈣的濃度，大幅降低了實驗對儀器性能的要求。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：Elan DRC-e型，美國Perkin Elmer 公司；

電子天平：XS205型，瑞士Mettler Toledo公司；

超純水機：Mili-Q Adventage型，美國Millipore公司；

碳酸鈣標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號為SRM915b，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院；

人血清成分電解質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號為SRM 956c，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院；

冷凍人血清中無機成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號為GBW 09152，中國計量科學(xué)研究院；

42CaCO3：純度為94.37%，編號為139691，美國橡樹嶺實驗室；

硝酸：BV–III級，北京化學(xué)試劑研究所；

實驗用水由Mill Q超純水系統(tǒng)制備。

1.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀工作參數(shù)

ICP射頻電壓：1 100 V；霧化器氣體流量：0.97 L／min；離子透鏡電壓：6.75 V；模擬信號電壓：–1 700 V；脈沖信號電壓：900 V；延遲時間：2 ms；掃描方式：峰高；掃描次數(shù)：25；單次測量讀取次數(shù)：25；重復(fù)次數(shù)：25；甲烷流量：0.9 mL／min；氬氣流量：0.8 mL／min；測量質(zhì)量數(shù)：42和44；冷卻水溫：20℃；進(jìn)樣流量：1 mL／min；分析模式：同位素比。

1.3 溶液的制備

一級鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將稱量瓶洗凈烘干，冷卻后直接倒入大于0.20 g的CaCO3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粉末，于105℃下烘干2 h。取出冷卻，于干凈容器中稱取0.12 g的CaCO3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加入2 mL的BV–III級濃硝酸，溶解后加超純水稀釋至總質(zhì)量約為45 g，保存?zhèn)溆?。定值前平行配?份一級鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，以進(jìn)行重復(fù)性驗證，3份溶液濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于1%。

二級鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取15 mL一級鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋至45 mL，配制成二級鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋前后的量值以天平稱量的質(zhì)量為計算量。

一級濃縮同位素稀釋劑的配制：稱取約1 mg的42Ca同位素于干凈容器中，加入0.20 mL BV–III級濃硝酸，加超純水稀釋至總質(zhì)量約為100 g，保存?zhèn)溆谩?/p>

二級濃縮同位素稀釋劑配制：取1 mL一級濃縮同位素稀釋劑，用超純水稀釋至45 mL。

鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液與濃縮同位素稀釋劑混合樣品的制備：分別稱取mzc(約0.15 mL)的二級鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液與mYc(約0.20 mL)的“二級濃縮同位素稀釋劑”混合后用超純水稀釋到45 mL，兩種試劑的加入量均稱重并以質(zhì)量帶入計算。

血清樣品與濃縮同位素稀釋劑混合樣品的制備：分別稱取0.3～0.5 mL（mzg）的血清樣品，與0.20 mL二級濃縮同位素稀釋劑(mYg)混合后用超純水稀釋到45 mL，兩種試劑的加入量均以實際稱得質(zhì)量計算。

鈣標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制：取0.15 mL二級鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水稀釋至45 mL。

濃縮同位素工作溶液配制：取1.0 mL二級濃縮同位素稀釋劑，用超純水稀釋至45 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的選擇

2.1.1 甲烷反應(yīng)氣流量的設(shè)定

質(zhì)譜法分析鈣元素時，氬氣干擾很嚴(yán)重，Elan DRC-e型儀器可以利用通入甲烷氣體消除氬氣的干擾，因為42Ca比44Ca豐度小很多，所以氬氣對42Ca比對44Ca的相對干擾要嚴(yán)重。實驗中以檢測42Ca確定甲烷與氬氣的最佳流速。利用儀器自帶的“反應(yīng)池碰撞氣體流量優(yōu)化”模式，找到甲烷、氬氣的最佳流速分別為0.9，0.8 mL／min，經(jīng)驗證在此條件下氬氣對44Ca 的干擾基本消除。

2.1.2 分析時間參數(shù)的設(shè)定

使用Boulyga［14］等反應(yīng)池模式測定44Ca／40Ca值時的實驗參數(shù)，44Ca／42Ca值的重復(fù)性不能滿足定值要求。當(dāng)掃描次數(shù)、單次測量讀樣次數(shù)及重復(fù)次數(shù)均設(shè)置為25時，數(shù)據(jù)的重復(fù)性明顯優(yōu)于前者，此時的單次分析時間約為5 min。將sweeps，readings，replicates視為3個獨立的測量次數(shù)的參數(shù)，25∶25∶25的結(jié)果也符合不確定度計算公式。

2.1.3 硝酸濃度變化對44Ca／42Ca值的影響

配制硝酸底液濃度不同的1.00 μg／mL Ca溶液，在相同實驗條件下測定44Ca／42Ca值，結(jié)果見表1。由表1可知，酸度變化時對同位素比值沒有明顯的影響，但cps響應(yīng)信號隨酸度的增加而減小。因此，在配制基準(zhǔn)溶液和樣品溶液時，不必考慮酸度的差異，為了使信號強度最大，對于血清樣本可直接進(jìn)行稀釋。

表1 硝酸含量對44Ca／42Ca值測定結(jié)果的影響

2.1.4 鈣濃度變化對44Ca／42Ca值的影響

綜上所述，骨關(guān)節(jié)結(jié)核在發(fā)生與發(fā)展的過程中，伴隨著機體內(nèi)多種細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化，IL-15、MCP-1和TGF-β含量顯著增高，提示其可能參與骨關(guān)節(jié)結(jié)核的免疫調(diào)節(jié)過程，但其具體機制尚未明確，有待深入研究。IL-15、MCP-1和TGF-β的表達(dá)水平有望成為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的預(yù)防、診斷、病情監(jiān)測及判斷預(yù)后的重要臨床參考指標(biāo)。

不同質(zhì)量濃度鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液44Ca／42Ca值的測定結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)鈣質(zhì)量濃度為0.5～1.5 μg／mL時，測量結(jié)果穩(wěn)定性與重復(fù)性均很好；而當(dāng)鈣質(zhì)量濃度較低時，儀器的重復(fù)性和本底空白值明顯影響44Ca／42Ca值的重復(fù)性和穩(wěn)定性。因此血清樣本稀釋后的鈣質(zhì)量濃度在0.5～1.5 g／mL范圍時，測定結(jié)果的重復(fù)性較好。

表2 不同濃度鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液44Ca／42Ca值的測定結(jié)果

2.1.5 程序的確定

為了保證基準(zhǔn)溶液濃度的準(zhǔn)確性，定值分析時二級以下的溶液均為當(dāng)天配制［15］。為了獲得同位素比測量的最佳精度，在樣品和同位素稀釋劑的混合試樣中使同位素比盡量接近于1［10］。在數(shù)據(jù)處理過程中發(fā)現(xiàn)RZ和RY的波動性對最終結(jié)果影響很小，而RB與RBC的測量波動性對最終的結(jié)果是有影響的，因此RB與RBC必須交替測定，這樣可同時消除儀器的測量漂移引入的誤差。對于每份血清樣本獨立稀釋成3個混合試樣，每個混合試樣進(jìn)行6次獨立分析，取其均值。

樣品中鈣的質(zhì)量濃度根據(jù)式(1)計算［11］：

式中：cZ——鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度；

mY——血清樣品與濃縮同位素稀釋劑混合時濃縮同位素稀釋劑加入的質(zhì)量；

mX——血清樣品與濃縮同位素稀釋劑混合時血清樣品加入的質(zhì)量；

mZC——標(biāo)準(zhǔn)溶液與濃縮同位素稀釋劑混合時鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液加入的質(zhì)量；

Rz——鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液中44Ca／42Ca的同位素豐度比；

RY——濃縮同位素稀釋劑中44Ca／42Ca的豐度比；

RB— —血清樣品與濃縮同位素稀釋劑混合物中44Ca／42Ca的豐度比；

REC——鈣標(biāo)準(zhǔn)溶液與濃縮同位素稀釋劑混合物中44Ca／42Ca的豐度比。

2.2 重復(fù)性

按照建立的定值方法對自制的leve1–3冷凍人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，數(shù)據(jù)見表3。表3中，前3個數(shù)據(jù)為第1天的定值結(jié)果，后3個數(shù)據(jù)為第2天的定值結(jié)果。

表3 3個水平人血樣本Ca含量的定值數(shù)據(jù)

2.3 準(zhǔn)確性

按照建立的定值方法對NIST 956c和GBW 09152人血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的鈣進(jìn)行準(zhǔn)確度驗證，測定結(jié)果見表4。

表4 NIST 956c和GBW 09152標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中Ca含量測定結(jié)果

3 結(jié)語

建立了在動態(tài)反應(yīng)池模式的四級桿電感耦合等離子體質(zhì)譜儀上用同位素稀釋質(zhì)譜法定值血清中總鈣的參考方法，取得了滿意的定值結(jié)果。驗證了兩步同位素稀釋質(zhì)譜法公式的實用效果。定值過程中減少了被測同位素的量，降低了對質(zhì)譜儀器的要求，定值結(jié)果準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，本法可以作為實驗室測定血清中鈣的參考方法。

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