徐海燕，曹 斌，辛國芹，汪祥燕，汪孟娟，董佩佩，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安 271000）

L-谷氨酰胺（Gln）是 L-谷氨酸 γ-羧基酰胺化的一種氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸之一，在生物體代謝中起著非常重要的作用（劉春暉和張偉國，2009）。生產(chǎn)L-Gln的方法主要包括化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和直接發(fā)酵法，目前Gln的生產(chǎn)均采用發(fā)酵法。李爽等 （1998）以黃色短桿菌SGr和DONr抗性菌株作為生產(chǎn)菌株，采用16 L發(fā)酵罐發(fā)酵44 h，L-Gln的合成量達(dá)到55.2 g/L。張克旭等（1992）以天津短桿菌TG-866-174為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝基胍和硫酸二乙酯誘變得到菌株GW-77，可代謝累積L-Gln 31.4 g/L，最高可產(chǎn)33.2 g/L。 Yamada 等（1979）對產(chǎn)黃菌（Flavobacterium rigense）FERM-P no.3556進(jìn)行紫外誘變，得到了一株具有青霉素抗性的突變菌株FERM-P no.3628，可產(chǎn) L-Gln 25 g/L。汪世華等（2002）對谷氨酸棒桿菌S9114進(jìn)行紫外線及硫酸二乙酯（DES）誘變處理，定向選育出1株生產(chǎn)菌SH44，其L-Gln產(chǎn)量可代謝累積達(dá)到41.4 g/L左右。本試驗旨在利用紙層析法定向篩選L-Gln產(chǎn)生菌，并通過紫外線和化學(xué)誘變劑對菌株進(jìn)行誘變選育，使其合成L-Gln的能力進(jìn)一步提升，同時采用正交試驗對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 果蔬攤土、活禽攤土、樹林土等。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 分離培養(yǎng)基 葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、酵母膏0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、制霉素50 U/mL，瓊脂1.5%，pH 7.0，30℃培養(yǎng) 24 h。

1.2.2 活化斜面培養(yǎng)基 葡萄糖0.1%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、瓊脂粉1.5%，pH 7.0，30℃培養(yǎng) 24 h。

1.2.3 斜面保存培養(yǎng)基 蛋白胨1%、牛肉膏1%、氯化鈉0.5%，瓊脂 1.5%，pH 7.0。

1.2.4 種子培養(yǎng)基 葡萄糖4%、尿素0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸鎂0.05%、玉米漿2.2%，pH 7.0，30℃培養(yǎng) 12 h。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖12%、磷酸二氫鉀0.25%、硫酸鎂 0.05%、硫酸錳 4 mg/L、硫酸鋅2.5 mg/L、玉米漿 1%、硫酸銨7%，pH 7.0。

1.2.6 完全培養(yǎng)基 葡萄糖0.5%、牛肉膏1%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化鈉0.5%、瓊脂粉1.5%，pH 7.0。

1.2.7 篩選培養(yǎng)基

1.2.7.1 磺胺胍（SG）藥物培養(yǎng)基 在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加適量的SG（400～800 mg/L）。

1.2.7.2 高濃度硫酸銨培養(yǎng)基 在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加適量的硫酸銨（60～100 g/L）。

配制發(fā)酵培養(yǎng)基時，硫酸銨配成400 g/L的溶液，用NaOH溶液調(diào)pH 7.0，與發(fā)酵液分開滅菌，接種前與發(fā)酵液混合。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的分離篩選 取果蔬攤土、活禽攤土等土樣5.0 g，置于盛有50 mL滅菌生理鹽水的250 mL三角瓶內(nèi)，進(jìn)行梯度稀釋，選取合適稀釋度的樣品液涂布于分離培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h，挑選生長良好、菌落較大的單菌落，接種于斜面培養(yǎng)基上，冰箱4℃保藏。

初篩菌種的初步鑒定：將初篩到的菌種進(jìn)行革蘭氏染色，革蘭氏陽性菌保存，革蘭氏陰性菌棄用。

紙層析法復(fù)篩菌種：將初篩得到的革蘭氏陽性菌菌株搖瓶振蕩培養(yǎng)24 h，利用紙層析法鑒定發(fā)酵液中是否含有L-Gln，定性復(fù)篩產(chǎn)L-Gln的菌株。

1.3.2 菌種生長曲線的測定 將菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，每2 h取樣一次測定發(fā)酵液的OD562（以空白培養(yǎng)基作對照），繪制生長曲線。

1.3.3 菌株的培養(yǎng)方法

1.3.3.1 液體種子培養(yǎng) 將斜面菌種接種到裝有10 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，30℃、170 r/min搖床振蕩培養(yǎng)8 h。

1.3.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 500 mL三角瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，接入一環(huán)菌體或液體種子1 mL，30℃、170 r/min搖床振蕩培養(yǎng)60 h。

1.3.4 菌株的誘變

1.3.4.1 紫外誘變 把待誘變菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5000 r/min離心5 min，去上清液，把菌體用無菌水再次離心洗滌，將菌體加入到含有玻璃珠的15 mL無菌生理鹽水中振蕩20 min，然后用無菌生理鹽水稀釋至108個/mL，將2 mL稀釋的菌液加至無菌平皿中，放入無菌磁力攪拌子，再將平皿放在操作臺紫外燈下照射20、40、60 s，照射后吸取菌體進(jìn)行逐級稀釋，并涂平板進(jìn)行培養(yǎng)，挑取長得快、菌落大的進(jìn)行斜面保存。

1.3.5 分析方法

1.3.5.1 L-Gln含量的測定 采用紙層析法。（1）展開：采用新華3號濾紙，每個樣品點樣1 μL，在室溫下用不飽和法展開，展開劑用（苯酚∶水=4∶1）上行法展開；（2）定量：配制1%的Gln標(biāo)準(zhǔn)品，點樣1 μL；菌株發(fā)酵液經(jīng)離心后，取其上清液點樣1 μL，放入層析缸中展開；（3）顯色：展開完畢后用電吹風(fēng)吹干濾紙，噴上0.5%的茚三酮無水乙醇溶液，60℃顯色30 min；（4）比色測定：剪下Gln斑點，用5 mL硫酸銅乙醇溶液（0.1%硫酸銅溶液∶75%乙醇=2∶38）浸泡 30 min，然后在 510 nm 處測定A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的A值和樣品的A值即可計算出樣品的L-Gln的含量。

1.3.5.2 pH的測定 采用PHS-3C型精密pH測定。

1.3.6 菌株的鑒定

1.3.6.1 16S rDNA的擴增與序列分析 目的菌株接種于新鮮的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，采用天根公司的試劑盒提取菌體DNA，并對其進(jìn)行16S rDNA序列擴增。所用引物為通用引物：1492r 5'-ggttaccttgttacgactt-3'27f 5'-agagttgatcctggctcag-3'；PCR 反應(yīng)體系（50 μL）為：Mixture 25 μL（含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司），上下游引物各 1 μL，模板 DNA 2 μL，超純水21 μL。PCR擴增程序為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，52℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.3.6.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 登錄 GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對菌株16SrDNA測序結(jié)果利用Blast進(jìn)行檢索，并下載相關(guān)屬種的16S rDNA 序列， 采用 DNAMAN、DNAclub、MEGA3.1等軟件進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離篩選

2.1.1 菌種的初篩 從泰安周邊的樹林土、果蔬攤土、活禽攤土等樣品中進(jìn)行菌株的分離、篩選。經(jīng)過1～2 d的培養(yǎng)，平板上出現(xiàn)明顯的菌落，經(jīng)過反復(fù)分離純化，共分離出細(xì)菌菌株56株；菌株菌落多為白色、黃色、淺黃色，還有部分為褐色、黃褐色，菌落多數(shù)為圓形，表面光滑；菌體多為粗短不一的桿狀、球狀。將其中革蘭氏染色為陽性的菌株保存?zhèn)溆?，共保?2株。

土木工程的項目施工過程有很強的流動性，當(dāng)前施工工程規(guī)模不斷擴大，造成了當(dāng)前土木工程的施工地點往往不固定，施工中需要進(jìn)行多次的移動。同時，土木工程中施工人員大都未能經(jīng)過完善的訓(xùn)練和學(xué)習(xí)，專業(yè)施工技術(shù)的缺乏使得土木工程施工技術(shù)使用存在不足，且施工人員流動性強。這兩類問題往往造成了施工內(nèi)容和施工質(zhì)量的不穩(wěn)定，直接影響了土木工程施工效率和施工質(zhì)量。

2.1.2 菌種的復(fù)篩 紙層析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從活禽攤土分離到的菌株的發(fā)酵液均有層析帶出現(xiàn)，果蔬攤土及樹林土中分離到的菌株中僅有個別的菌株有層析帶的出現(xiàn)，并且與L-Gln標(biāo)準(zhǔn)品在同一位置。表明這些菌株的發(fā)酵液中含有L-Gln，其中有6株的L-Gln的含量在1 g/L以上，但含量最高的也僅有2 g/L左右，其編號為BL-12。

2.2 菌株BL-12的誘變選育 菌株BL-12經(jīng)過紫外線和硫酸二乙酯化學(xué)誘變，再經(jīng)過磺胺胍、高濃度硫酸銨平板篩選和搖瓶發(fā)酵，篩選得到一株具有磺胺胍、高濃度硫酸銨抗性的菌株BLCC7-0162，在未經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化的條件下，可產(chǎn)生L-Gln 8.0 g/L左右。

2.3 菌株BLCC7-0162生長曲線的測定 由圖1可以看出，菌株BLCC7-0162的延滯期是0～2 h，較短，2 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，10 h達(dá)到穩(wěn)定期，穩(wěn)定期持續(xù)的時間比較長。

2.4 菌株BLCC7-0162發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

圖1 菌株BLCC7-0162的生長曲線

2.4.1 碳酸鈣濃度對菌株合成L-Gln的影響 發(fā)酵液中由于硫酸銨的不斷利用及伴隨著谷氨酸和L-Gln的形成，使發(fā)酵液的pH值下降，進(jìn)而影響菌株的生長和產(chǎn)物的形成。碳酸鈣具有緩沖發(fā)酵液pH的作用，因此可使pH維持在一個比較適宜的水平。從圖2可以看出，不同的碳酸鈣添加水平對菌株合成L-Gln的能力有較大的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加3%的碳酸鈣更有利于L-Gln的積累。過高，會影響菌體生長和發(fā)酵期間的溶氧，過低，無法中和氫離子，導(dǎo)致發(fā)酵液pH下降，不利于L-Gln的合成。

圖2 碳酸鈣濃度對L-Gln產(chǎn)量的影響

2.4.2 葡萄糖濃度對菌株合成L-Gln的影響 葡萄糖能夠直接影響到菌體的生長和產(chǎn)酸的水平。本試驗采用不同濃度的葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵。從圖3可以看出，葡萄糖含量在12%以下時，L-Gln產(chǎn)量相對較高，大于14%時L-Gln產(chǎn)量明顯下降。

圖3 葡萄糖濃度對L-Gln產(chǎn)量的影響

2.4.3 硫酸銨濃度對菌株合成L-Gln的影響 硫酸銨為菌株的生長提供了氮源，同時高濃度的NH4+是L-Gln發(fā)酵中抑制谷氨酸合成以及刺激L-Gln合成的必要條件，所以要求培養(yǎng)基中必須有較高水平的硫酸銨。但NH4+的濃度過高會抑制L-谷氨酰胺合成酶的活性，不利于L-谷氨酸向L-谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化。從圖4可以看出，硫酸銨濃度在6%以下時，L-Gln的合成相對較高，其中以4%時產(chǎn)量最高，在7%以上明顯下降。

圖4 硫酸銨濃度對L-Gln產(chǎn)量的影響

2.4.4 玉米漿濃度對菌株合成L-Gln的影響 由于玉米漿的主要成分是氨基酸和多肽類，還含有豐富生長因子，成分較復(fù)雜，其成分受玉米來源及處理方法的影響而不同。本試驗考察了添加不同濃度的玉米漿對菌株合成L-Gln的影響，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，隨著玉米漿濃度的增加，L-Gln的合成量呈下降趨勢，添加量為0.5%時，L-Gln的合成量相對較高。

圖5 玉米漿濃度對Gln產(chǎn)量的影響

2.4.5 不同初始pH對菌株合成L-Gln的影響L-Gln在菌株合成累積的過程中會被L-谷氨酰胺酶降解為谷氨酸。谷氨酸是酸性氨基酸，在堿性條件下更利于谷氨酸的生成，同時由于本試驗中添加了具有pH緩沖作用的碳酸鈣，所以本試驗采用不同的初始pH進(jìn)行菌株對L-Gln合成的影響，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，起始pH為7.0～7.5時更有利于L-Gln的生成。

圖6 不同初始pH對L-Gln產(chǎn)量的影響

2.4.6 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基組成 根據(jù)上述各因素的單因子試驗結(jié)果，對葡萄糖、硫酸銨及玉米漿進(jìn)行3因素3水平試驗，結(jié)果見表1。由表1可以看出，影響L-Gln產(chǎn)量的因素的主次順序為：葡萄糖＞玉米漿＞硫酸銨。試驗所得的最佳組合為A2B2C2，即葡萄糖12%、硫酸銨5%、玉米漿1%。采用此配方，進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果顯示，L-Gln的產(chǎn)量為（45.82±1.23）g/L。 因此，后續(xù)試驗采用此配方進(jìn)行。

表1 L9（33）正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

2.4.7 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基中無機鹽的組成 以篩選出的葡萄糖12%、硫酸銨5%、玉米漿1%、碳酸鈣3%為基礎(chǔ)配方，進(jìn)行硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸錳及磷酸二氫鉀的四因素三水平正交試驗。由表2試驗結(jié)果可以看出，影響L-Gln產(chǎn)量的因素的主次順序為：磷酸二氫鉀>硫酸鋅＞硫酸鎂＞硫酸錳。試驗所得的最佳組合為A2B1C1D2，即磷酸二氫鉀 0.1%、硫酸鎂 0.04%、硫酸錳 2 mg/L、硫酸鋅2.5 mg/L。采用此配方，進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果顯示，L-Gln 的產(chǎn)量為（46.89±1.06）g/L。

2.5 菌株BLCC7-0162的鑒定

2.5.1 菌落及菌體形態(tài) 該菌株在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，其菌落呈圓形，白色，邊緣整齊，表面光滑、濕潤，顯微鏡下觀察菌體呈短桿至小棒狀，有時微彎曲，兩端鈍圓，單個或成八字排列，革蘭氏染色陽性。

2.5.2 16S rDNA序列和系統(tǒng)發(fā)育分析 該菌株的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在分子量大小為1500 bp左右得到一條特異性好的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖7）。

表2 L9（34）正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

圖7 菌株BLCC7-0162 16S rDNA的PCR電泳圖

將菌株BLCC7-0162的16S rDNA序列與http：//www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上己登錄的部分菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示菌株BLCC7-0162與已報道的Corynebacterium glutamicum （DQ171711.1）的序列同源性達(dá)到100%。鑒定該菌株屬于谷氨酸棒狀桿菌。

選擇與BLCC7-0162同源性較高的部分已登錄的相關(guān)菌株序列，用ClustalX1.83軟件進(jìn)行陣列比對后利用MEGA 3.1軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖8）。

3 小結(jié)

3.1 從樹林土、果蔬攤土、活禽攤土等樣品中分離篩選到6株產(chǎn)L-Gln含量在1 g/L以上的菌株，發(fā)現(xiàn)其中活禽攤土是L-Gln產(chǎn)生菌較好的來源。

圖8 菌株BLCC7-0162與相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

3.2 以BL-12為出發(fā)菌株，經(jīng)過紫外線及化學(xué)（硫酸二乙酯）誘變，再通過磺胺胍、高濃度硫酸銨定向篩選，得到一株產(chǎn)L-Gln能力較強的菌株BLCC7-0162，在未經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化的條件下，三角瓶發(fā)酵48 h可以產(chǎn)生8.0 g/L的L-Gln。

3.3 通過對發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，菌株BLCC7-0162經(jīng)60 h搖瓶發(fā)酵后L-Gln產(chǎn)量達(dá)到47 g/L左右。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：葡萄糖12%、硫酸銨5%、玉米漿1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.04%、硫酸錳2 mg/L、硫酸鋅2.5 mg/L、碳酸鈣3%、初始pH 7.0～7.5。

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