Ad-HGF轉(zhuǎn)染LMC培養(yǎng)上清液對(duì)大鼠大腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用

丁紀(jì)超劉旻張曉鑫李彤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000)

摘要〔〕目的探討Ad-HGF轉(zhuǎn)染大鼠腦膜間皮細(xì)胞(RMMCs)得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液促腦血管新生的分子調(diào)控及相關(guān)作用。方法無(wú)菌條件下取出生1～2 d SD大鼠的腦組織，采用機(jī)械吹打、輕消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)大鼠腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，傳3代后，通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞HE染色、第Ⅷ因子相關(guān)抗原、細(xì)胞免疫熒光染色等三方面進(jìn)行細(xì)胞鑒定；通過(guò)MTT法檢測(cè)Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；通過(guò) Transwells法檢測(cè)對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；通過(guò)免疫印跡(WB)法檢測(cè)CAEC中TGF-β1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果Transwells細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)見(jiàn)PVPE膜上大量被結(jié)晶紫染色的CAEC；隨機(jī)選取100倍視野下細(xì)胞遷移的數(shù)量進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)；MTT法發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組也有顯著性差異(P<0.05)；同一時(shí)間點(diǎn)，隨著Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液及外源性HGF濃度增加，CAEC中TGF-β1平均光密度值逐漸降低，TGF-β1平均光密度值呈一定量相關(guān)性，差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論采用機(jī)械吹打、胰酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法可以成功獲取高純度大鼠CAEC；Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液具有促進(jìn)大鼠CAEC增殖和遷移的作用；Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液及HGF具有抑制CAEC中TGF-β1蛋白表達(dá)的作用。

關(guān)鍵詞〔〕肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞；血管新生；基因治療；神經(jīng)保護(hù)

中圖分類號(hào)〔〕R39〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：河南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(112101310400)；河南省科技廳資助項(xiàng)目(082102310015)

通訊作者：李彤(1963-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病研究。

第一作者：丁紀(jì)超(1986-)，男，在讀碩士，主要從事腦血管疾病的綜合治療與基礎(chǔ)研究。

大腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(CAEC)是構(gòu)成血腦屏障的主要成分，具有活躍的分泌、合成、代謝及免疫功能，可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和生物活性物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生理活動(dòng)，是各種生理、病理因素的靶細(xì)胞。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)為一獨(dú)立的促血管生成因子，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、促軸突發(fā)生〔1〕、血管發(fā)生、減少膠質(zhì)瘢痕合成〔2〕以及促進(jìn)腦室管膜下區(qū)相關(guān)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化作用〔3〕。TGF-β1為調(diào)控血腦屏障完整性的重要因子，與HGF相互作用的效應(yīng)因?yàn)榧?xì)胞、細(xì)胞環(huán)境及細(xì)胞內(nèi)主要活性因子不同而不同，尤其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)化的調(diào)控HGF-TGF-β1平衡具有重要作用。本課題前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ad-HGF可以顯著減少治療組大鼠腦組織TGF-β1的表達(dá)，隨著HGF的表達(dá)量增加TGF-β1的表達(dá)下降，表明Ad-HGF可能通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)促進(jìn)血管新生，減少腦缺血引起的神經(jīng)損傷。本實(shí)驗(yàn)期望為明確Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液對(duì)大鼠CAEC是否具有促血管新生作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器出生1～2 d健康Sprague-Dawley(SD)大鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液來(lái)自河南省神經(jīng)病學(xué)研究所DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Hyclone)、胰蛋白酶(Gibco)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(武漢博士德)、D-Hank液(Gibco)、二甲基亞砜(DMSO)(Amersham)、臺(tái)盼藍(lán)(Sigma)、噻唑蘭(MTT)、SERVAFITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢博士德)、兔抗大鼠第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體(Rabbit Anti-factor Ⅷ)，(北京博奧森DAB顯色試劑盒)、HGF(h)武漢博士德、ELISA kit(96T)(武漢博士德)、封閉用山羊血清(武漢博士德)，其余試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

純化水系統(tǒng)(Dlamond RO型)、Thermo Scientific超純水器(NANOpure Dlamond型)、Thermo Scientific電子分析天平(TE612-L型)(Sartoulus)、超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD型)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、倒置相差顯微鏡(TS100-F型)(日本Nikon)、免疫熒光顯微鏡(ECLIPSE 55i型)(日本Nikon)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(371高溫滅菌型)(Thermo Scientific)、超低溫冰箱(Thermo Forma型)、全自動(dòng)滅菌柜(HVE-50型)(Thermo Scientific)，日本Hiayama低溫高速離心機(jī)(CL31R型)、Thermo Scientific低速離心機(jī)、北京廣安醫(yī)療器械廠微量可調(diào)加樣器(Thermo Forma型)、Thermo Scientific恒溫干燥箱、(DHG-9140型)電熱恒溫水溫箱、Thermo Scientific臺(tái)式精密PH計(jì)(MODEL818型)、Thermo Orion Z-C恒溫振蕩器、酶標(biāo)儀(MK3型)、Thermo Scientific細(xì)胞培養(yǎng)瓶、美國(guó)Coning細(xì)胞凍存管、Transwells細(xì)胞遷移板(美國(guó)Costar)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定無(wú)菌條件下取出生1～2 d SD大鼠腦組織，采用機(jī)械吹打、輕消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法〔4〕原代培養(yǎng)大鼠腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，傳3代后，通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞HE染色、第Ⅷ因子相關(guān)抗原、細(xì)胞免疫熒光染色等三方面進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.3HGF及Ad-HGF感染LMC上清液對(duì)CAEC細(xì)胞增殖的影響體積分?jǐn)?shù)0.125%胰蛋白酶-EDTA消化CAEC細(xì)胞后，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×107/L。實(shí)驗(yàn)分3組：第一組為空白組，不添加HGF及Ad-HGF感染LMC上清液，取96孔板，每天在固定時(shí)間增設(shè)4個(gè)復(fù)孔，放入溫箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液一次。第2組為添加HGF組，取96孔板，每天在固定時(shí)間增設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并加入等量100 ng/L濃度的HGF，放入溫箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液一次。第3組為Ad-HGF感染LMC上清液組，取96孔板，每天在固定時(shí)間增設(shè)4個(gè)復(fù)孔，并加入相同效應(yīng)的Ad-HGF感染LMC上清液，放入溫箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液一次。7 d后，在同一時(shí)間取出96孔板，每組取4個(gè)孔均吸棄培養(yǎng)液后，每孔加MTT 20 μl(實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組每孔滴加MTT前用PBS輕輕沖洗2遍以減少誤差)，放入37℃溫箱孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)MTT，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min使紫色結(jié)晶物甲瓚充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀選擇570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值。

1.4遷移實(shí)驗(yàn)取1塊Transwell小室的24孔板，每3個(gè)小室為1組，分為實(shí)驗(yàn)組(加入Ad-HGF感染LMC上清液)和對(duì)照組(空白組)。將CAEC細(xì)胞用含胎牛血清蛋白(10 g/L)的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度為3×108/L。 每個(gè)小室加入100 μl的細(xì)胞懸液，在小室下方的孔內(nèi)，每個(gè)孔加入600 μl含體積10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。小室內(nèi)再加入HGF含量為100 ng/ml濃度的Ad-HGF感染LMC上清液1 ml，將6個(gè)小室置于溫箱中孵育16 h后，每個(gè)小室及下室加入體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛共1 ml，固定細(xì)胞5 min，然后加入體積分?jǐn)?shù)100%甲醛1 ml，在室溫下通透細(xì)胞20 min，再加入姬姆薩染液1 ml，細(xì)胞染色15 min，吸棄姬姆薩染液并用PBS洗滌2遍，用棉簽輕輕擦去聚碳酸酯膜上層細(xì)胞，光鏡100倍下每孔按上、中、下、左、右攝取5張照片，計(jì)數(shù)并組遷移細(xì)胞數(shù)。

1.5免疫印跡(WB)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)設(shè)定不同濃度HGF組及Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液組，在同一時(shí)間點(diǎn)通過(guò)WB法檢測(cè)CAEC中TGF-β1蛋白表達(dá)情況。體積分?jǐn)?shù)0.125%胰蛋白酶-EDTA消化CAEC細(xì)胞后，用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞，將重懸的細(xì)胞按2∶5傳代至5個(gè)培養(yǎng)皿中，為HGF組分別編號(hào)為a1、b1、c1、d1、e1。細(xì)胞濃度為1.7×105/ml，每皿細(xì)胞數(shù)為6.8×105/L，設(shè)定a1為空白對(duì)照組，其他各組加入外源性HGF濃度依次為10、20、40、80 ng/ml。同樣方法設(shè)Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液組，分別編號(hào)為a2、b2、c2、d2、e2，a2為空白對(duì)照組，其他各組加入等效Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液。用含20%胎牛血清的培養(yǎng)液將每皿中的培養(yǎng)液體積調(diào)整為13 ml。置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。取出10個(gè)CAEC細(xì)胞培養(yǎng)皿，PBS沖洗兩遍，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用BCA法行總蛋白定量。采用5%濃縮膠和10%分離膠行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為100 V，電泳總時(shí)間約為2 h。將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜位于陽(yáng)極側(cè)，凝膠位于陰極側(cè)，采用150 mA電流，電轉(zhuǎn)1.5 h。用5%的脫脂奶粉對(duì)轉(zhuǎn)有蛋白條帶的膜進(jìn)行封閉1.5 h，洗膜后分別與1∶200兔抗鼠TGF-β1、1∶200兔抗鼠GAPDH抗體4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入1∶4 000羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h。再次洗膜。轉(zhuǎn)移至暗室中，將PVDF膜上的TBST液用吸水慮紙吸出，置于干凈的培養(yǎng)皿中，取等量的超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物A液及B液混勻，將其滴加膜上，放入暗盒中曝光。用Quantity One軟件分析，以相應(yīng)蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度值表示相對(duì)蛋白含量。

2結(jié)果

2.1CAEC細(xì)胞形態(tài)及鑒定通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察大鼠腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)48 h換液后，可見(jiàn)大量細(xì)胞從動(dòng)脈血管段游出，呈短梭形或多角形。培養(yǎng)9 d，可見(jiàn)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔，形成典型的“鋪路石”樣外觀，細(xì)胞大小、形狀較為均一，融合度達(dá)80%以上，見(jiàn)圖1。原代細(xì)胞培養(yǎng)9 d 后，細(xì)胞鋪滿瓶底行消化傳代，經(jīng)傳代的第3代細(xì)胞用于鑒定，HE染色，細(xì)胞呈短梭形或多角形，大小不等，細(xì)胞質(zhì)豐富，薄染為淡紅色，著色均勻，見(jiàn)圖2。在熒光倒置顯微鏡下觀察，傳代細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)內(nèi)均出現(xiàn)黃綠色熒光，即第Ⅷ因子抗原陽(yáng)性(見(jiàn)圖3)，陽(yáng)性率達(dá)90%，胞質(zhì)與胞核界限明顯，而對(duì)照細(xì)胞不染色(陰性)。

圖1　組織塊培養(yǎng)法CAEC細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(×100)

圖2　CAEC細(xì)胞形態(tài) (HE染色，×100)

圖3　細(xì)胞間接免疫熒光染色法鑒定RMMCs(×200)

2.2MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

2.3Transwells細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)見(jiàn)PVPE膜上大量被結(jié)晶紫染色的CAEC；隨機(jī)選取100倍視野下細(xì)胞遷移的數(shù)量進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.001)，見(jiàn)圖5。

2.4WB結(jié)果如圖6，圖7所示，同一時(shí)間點(diǎn)，隨著Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液及外源性HGF濃度增加，CAEC中TGF-β1蛋白表達(dá)平均光密度值逐漸降低，隨著時(shí)間增加，同一濃度的Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液及外源性HGF，CAEC中TGF-β1蛋白表達(dá)平均光密度值逐漸增加，TGF-β1平均光密度值呈一定量相關(guān)性，HGF組同一濃度不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.001)，Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液組同一濃度不同時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.001)，HGF組及Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液同一濃度相同時(shí)間點(diǎn)差異顯著(P<0.001)。

圖4　加入HGF及Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液 不同時(shí)間作用于CAEC后細(xì)胞活力變化

A為對(duì)照組，PVPE膜上很少見(jiàn)遷移出來(lái)的CAECs；B為實(shí)驗(yàn)組，PVPE膜上可見(jiàn)大量被結(jié)晶紫染色的遷移出來(lái)的CAECs 圖5　Transwells細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(×100)

A：正常組;B～E：HGF 10、20、40、80 ng/L組 圖6　HGF組不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1蛋白表達(dá)

A：正常組;B～E：Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液組，含HGF分別為10、20、40、80 ng/L 圖7　Ad-HGF感染LmC培養(yǎng)上清液組TGF-β1蛋白表達(dá)

3討論

本實(shí)驗(yàn)表明采用機(jī)械吹打、胰酶消化法結(jié)合組織塊培養(yǎng)法可以成功獲取高純度大鼠腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液具有促進(jìn)大鼠腦動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用。相比于HGF，Ad-HGF可以顯著減少CAEC中TGF-β1蛋白表達(dá)，且隨著Ad-HGF的濃度增加，TGF-β1蛋白表達(dá)下降，表明Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液可能通過(guò)表達(dá)HGF及其他增效因子間接抑制了TGF-β1的表達(dá)量，促進(jìn)了CAEC的增殖。

HGF基因療法對(duì)于缺血性腦血管病的基因轉(zhuǎn)移載體包括腺病毒、脂質(zhì)體、單純皰疹病毒等。本實(shí)驗(yàn)課題選擇E1、E3缺失的Ad-HGF，避免了野生型腺病毒的復(fù)制產(chǎn)生。前期實(shí)驗(yàn)針對(duì)腺病毒治療的安全性問(wèn)題我們進(jìn)行了相關(guān)預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示腺病毒載體僅在給藥局部表達(dá)，持續(xù)2 w左右，使其在臨床應(yīng)用中更加安全。HGF基因轉(zhuǎn)染能夠增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成能力，減少新內(nèi)膜的形成，增加再內(nèi)皮化，釋放高濃度的可溶性HGF蛋白。Ad-HGF能夠產(chǎn)生10倍于單純貼壁單核細(xì)胞的HGF，與單獨(dú)的細(xì)胞和基因治療相比，基于細(xì)胞的HGF基因治療是有效的治療方法，能夠減少細(xì)胞移植數(shù)量的要求，增強(qiáng)新生血管形成〔5〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，HGF基因治療可以促進(jìn)低密度脂蛋白膽固醇經(jīng)由P13GAkt信號(hào)通路對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷〔6〕。越來(lái)越多的證據(jù)表明，TGF-β1參與血管內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞的細(xì)胞間信號(hào)通訊，對(duì)血腦屏障的完整性具有重要作用。TGF-β1也是一多效能活性因子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化與凋亡，涉及胚胎發(fā)育及疾病發(fā)生等多種生物效應(yīng)，其多效性因細(xì)胞不同而不同，并受細(xì)胞內(nèi)主要活性因子影響。在周圍血管形成的研究中發(fā)現(xiàn)主要為TGF-β1/ALKs/Smads(Smad 2/3/4)信號(hào)通路參與信號(hào)調(diào)控〔7〕。TGF-β1與HGF的相互作用依不同細(xì)胞、不同細(xì)胞環(huán)境具有相互促進(jìn)與相互抑制雙重效應(yīng)，突出表現(xiàn)為HGF-TGF-β1平衡在組織損傷后的纖維化(膠質(zhì)化)修復(fù)中具有明確的調(diào)控作用，HGF與TGF-β1相互平衡決定器官組織修復(fù)的結(jié)果〔8〕。 綜上所述，HGF基因轉(zhuǎn)染上清液相比較HGF能夠增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成能力，可能與多種細(xì)胞活性因子參與相關(guān)的信號(hào)調(diào)控有關(guān)系。

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〔2014-12-02修回〕

(編輯李相軍)