朱汝森++陳興貴++蘭柳波+李錦宏++楊帆

[摘要]目的 檢測人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長增殖的影響，評估應(yīng)用hMSCs治療人腦膠質(zhì)瘤的生物安全性。方法 獲取hMSC的條件培養(yǎng)基（hMSCs-CM）；實驗組人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251培養(yǎng)于hMSCs-CM，對照組U251細(xì)胞培養(yǎng)于hMSCs-CM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；以MTT實驗檢測細(xì)胞增殖能力的變化。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，與對照組比較培養(yǎng)于hMSCs-CM的實驗組U251細(xì)胞的增殖能力明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 hMSCs-CM可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，對hMSCs應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤治療的生物安全性問題需引起關(guān)注。

[關(guān)鍵詞]骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腦膠質(zhì)瘤；基因治療；細(xì)胞增殖

[中圖分類號] R318 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（b）-0013-03

Influence of human bone marrow mesenchymal stem cells on human glioma cells proliferation

ZHU Ru-sen1 CHEN Xin-gui2 LAN Liu-bo3 LI Jin-hong1 YANG Fan1

1.Department of Neurosurgery，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Zhanjiang 524001，China；2.Cancer Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Zhanjiang 524001，China；3.Institute of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical University，Guangdong Province，Zhanjiang 524023，China

[Abstract]Objective To detect the influence of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells （hMSCs） on glioma cell proliferation and evaluate the biological safety of treating glioma with hMSCs.Methods The hMSCs-conditioned medium （hMSCs-CM） was obtained；human glioma cells U251 in the experiment group were cultured in hMSCs-CM，and U251 in the control group was cultured in the basal medium of hMSCs-CM；changes of cell proliferation were detected by MTT assay.Results The results of MTT assay showed that，compared with the control group，the proliferation of U251 of the experient group that cultured in hMSCs-CM increased significantly，and the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion hMSCs-CM can promote the proliferation of U251，and it is need to pay attention to the biological safety of treating glioma with hMSCs.

[Key words]Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells；Glioma；Gene therapy；Cells proliferation

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stromal cells，MSCs）由于具有在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中獨特的遷移性及對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的定向遷移能力，在很多研究中發(fā)現(xiàn)可以有效地將治療基因轉(zhuǎn)送到腦膠質(zhì)瘤中，以MSCs作為基因載體對腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行靶向基因治療的研究近年來成為熱點[1-5]。目前更多的研究所關(guān)注的是MSCs作為基因載體這種應(yīng)用的有效性，而關(guān)于MSCs自身對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用未被重視。對于是否存在MSCs自身可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長增殖的風(fēng)險并未明確，而這關(guān)系到應(yīng)用MSCs治療腦膠質(zhì)瘤的生物安全性問題。本實驗通過檢測人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells，hMSCs）對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長增殖的影響，評估應(yīng)用hMSCs治療人腦膠質(zhì)瘤的生物安全性。

1材料與方法

1.1人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)

在前期的研究中已經(jīng)建立了獲取hMSCs的成熟方法[6]。抽取健康成人志愿者的骨髓組織，于Percoll細(xì)胞分離液（瑞典Pharmacia）中通過密度梯度離心獲取中間的有核細(xì)胞層，接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后換液，去除未貼壁的細(xì)胞，每周更換培養(yǎng)液兩次，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%后，以0.25% 胰酶+0.02% EDTA消化傳代。取第2～10代的細(xì)胞作后續(xù)實驗。

1.2人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力的檢測

將第2～5代的hMSCs以0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，按1×105個/cm2的密度培養(yǎng)于含有B27/N2（美國Gibco BRL）的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液，并加入20 ng/ml的EGF和bFGF（美國Sigma），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液每周更換一次，生長因子每周添加2次。培養(yǎng)10～15 d后，神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)可見形成。將神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞以4%的甲醛固定，通過常規(guī)免疫組化的方法檢測神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白nestin的表達(dá)。免疫組化實驗所使用的抗體及濃度為：兔抗人nestin，1∶500（美國Chemicon International）和山羊抗兔IgG Cy3，1∶100（美國Chemicon International）。細(xì)胞核以DAPI染色。

1.3人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基（hMSCs-CM）的制備

將hMSCs以0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接種于75 cm2的培養(yǎng)皿，加入DMEM-F12加10%胎牛血清，培養(yǎng)于含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%，以無血清的DMEM/F12洗滌，然后加入9 ml的DMEM/F12含0.1% BSA，培養(yǎng)3 d后，吸取培養(yǎng)液，通過離心（1000 g，5 min），并以孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，以去除細(xì)胞，獲得hMSCs-CM。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/F12含0.1% BSA）作為實驗的對照培養(yǎng)基（control medium）。

1.4 MTT實驗檢測hMSCs-CM對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖的影響

將對數(shù)期U251細(xì)胞以1×103個/孔接種于96 孔板，正常培養(yǎng)24 h后，吸除原培養(yǎng)基，以無血清的DMEM/F12洗滌后，實驗組加入200 μl hMSCs-CM，對照組加入200 μl對照培養(yǎng)基（control medium），每組設(shè)12個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后予換液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，于每孔加入5 μg/ml MTT溶液20 μl，以37℃孵育4 h后，將上清液全部棄去，每孔加入二甲亞砜（DMSO）溶液200 μl，溶解紫色結(jié)晶沉淀，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定其光密度（OD值）。實驗重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 hMSCs的獲取和鑒定

獲得的hMSCs通過傳代培養(yǎng)后的呈長梭形，貼壁牢固，通過誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，hMSCs可形成類似神經(jīng)干細(xì)胞構(gòu)成的神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)，組成神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞高度表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白nestin（圖1）。

2.2 hMSCs-CM對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251生長增殖的影響

獲得hMSCs條件培養(yǎng)基（hMSCs-CM），將hMSCs-CM的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)于hMSCs-CM的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251與對照組比較，生長更加旺盛（圖2A）。MTT實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)于hMSCs-CM的實驗組U251細(xì)胞增殖能力較對照組明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2B）。

3討論

腦膠質(zhì)瘤是人類一種重要的腫瘤相關(guān)的致死因素，盡管通過廣泛的外科切除及放療、化療等其他的治療手段，其預(yù)后一直以來都是很差；現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)治療手段對腦膠質(zhì)瘤治療所存在的困難是與其瘤細(xì)胞向周圍正常組織浸潤性生長的特性密切相關(guān)[7-8]。正是膠質(zhì)瘤細(xì)胞這種呈浸潤性生長的特性也使得一些基因治療策略以及局部介入的治療方法亦難以很好地到達(dá)浸潤到周圍正常組織的膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞[9-11]。MSCs基于其具有的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中獨特的遷移特性以及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞良好的趨向性，可以有效地將目的治療基因輸送到膠質(zhì)瘤細(xì)胞，因此也為腦膠質(zhì)瘤的基因治療帶來了新的希望。

然而，在臨床應(yīng)用前，對于hMSCs在為基因載體對腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行基因治療的生物安全性問題必須得到徹底的認(rèn)識和明確。有研究報道，當(dāng)MSCs和某些腫瘤細(xì)胞共同種植時可表現(xiàn)出促進(jìn)腫瘤生長的作用，其中包括乳腺癌[12-13]、卵巢癌[14]、黑色素瘤[15]及結(jié)腸癌[16]等。有研究指出，MSCs可整合到腫瘤間質(zhì)，并通過旁分泌一些細(xì)胞因子，包括CCL5、IL-6、及SDF-1α等促進(jìn)腫瘤的生長[12-14]；MSCs可作為腫瘤前體的成纖維細(xì)胞通過分化和分泌促癌因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中其重要作用[16]；MSCs亦可通過其免疫抑制的特性幫助腫瘤細(xì)胞逃避宿主的免疫監(jiān)控而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15]。然而，也有研究得到了一些相反的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MSCs與腫瘤細(xì)胞共同種植可以抑制腫瘤的生長，包括結(jié)腸癌[17]、肝細(xì)胞癌[18]、黑色素瘤[19]等。似乎對于MSCs移植后對腫瘤生長的作用是因腫瘤而異的，與一系列的因素有關(guān)，包括MSCs的獲取和培養(yǎng)的方法、實驗的模型、移植到腫瘤中的細(xì)胞數(shù)量、在腫瘤微環(huán)境中的生長因子和炎癥性細(xì)胞因子種類等因素[20]。

在本研究中，筆者將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251于體外培養(yǎng)于人hMSCs的條件培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)相對于培養(yǎng)于對照培養(yǎng)基的U251細(xì)胞，前者的生長增殖更加旺盛，MTT實驗結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖能力明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。hMSCs的條件培養(yǎng)基于體外可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，也提示臨床工作者應(yīng)該對hMSCs應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤治療的生物安全性問題需引起關(guān)注。

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（收稿日期：2017-02-27 本文編輯：任 念）