袁哈利 ，郝曉云 ，鄭學(xué)偉 ，李鴻彬 ，2

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子832003；2石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子832003）

黃萎病是棉花生產(chǎn)上危害嚴(yán)重的病害之一。黃萎病是土傳性維管束病害，其致病菌主要有2種即大麗輪枝菌[1-2]和黑白輪枝菌[3]，棉花黃萎病病萎癥狀的產(chǎn)生是由于木質(zhì)部導(dǎo)管被菌絲和繁殖的孢子堵塞和病原菌產(chǎn)生的毒素共同作用的結(jié)果。近年來(lái)，黃萎病在我國(guó)各棉區(qū)屢次大面積發(fā)生，給棉花產(chǎn)業(yè)造成極大損失[4-5]。因此，研究黃萎病致病機(jī)制，進(jìn)一步利用遺傳工程手段培育抗病品種具有重要意義和廣闊的應(yīng)用前景。

植物GDSL脂肪酶是一個(gè)大的基因家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、油脂代謝和防御反應(yīng)等[6-8]生理活動(dòng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。GDSL脂肪酶基因的表達(dá)能夠響應(yīng)生物和非生物脅迫。植物GDSL脂肪酶基因的表達(dá)可被病菌、水楊酸、乙烯、茉莉酸等激素以及非生物脅迫因子所誘導(dǎo)，表明他們可能參與植物抗病和應(yīng)激反應(yīng)[9-11]。GDSL脂肪酶可以通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)或者直接破壞真菌孢子的完整性，限制病原菌在感染地方生長(zhǎng)繁殖[9，12]。在抗病研究中，植物細(xì)胞內(nèi)的許多保護(hù)酶如過(guò)氧化氫酶（Catalase,CAT）、超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase,SOD）、過(guò)氧化物酶（Peroxidase,POD）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyas）和多酚氧化物酶（Polyphendoxidas,PPO）與植物的抗病能力有著密切的關(guān)系[13-15]。

棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，GDSL脂肪酶與黃萎病相關(guān)的研究少有報(bào)道。本研究從棉花中克隆了1個(gè)GDSL脂肪酶基因GhGLIP，對(duì)其在受到黃萎病脅迫時(shí)的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了初步分析；利用大麗輪枝菌菌對(duì)野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片分別處理，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株對(duì)黃萎病菌的抗性進(jìn)行了研究；對(duì)棉花GhGLIP抗黃萎病菌的機(jī)制進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步抗病品種培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

大麗輪枝菌（黃萎病菌）、哥倫比亞野生型Col-0擬南芥為本實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)過(guò)處理的葉片材料經(jīng)液氮速凍，于-80℃冰箱保存待用。

1.1.2 試劑

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯購(gòu)自上海銘睿生物科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

Eppendorf PCR儀、Eppendorf 5424R型離心機(jī)：Eppendorf North America；HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Tannon Epson100型核酸電泳儀：上海天能設(shè)備有限公司；ZF-158型凝膠成像分析系統(tǒng)：上海金鵬分析儀器有限公司；ZSD-A1270A恒溫培養(yǎng)箱、ZHWY-100B恒溫?fù)u床：上海智誠(chéng)分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取

RNA所用的EP管、槍頭、槍頭盒、試劑瓶等經(jīng)過(guò)DEPC水處理24 h，高壓滅菌處理后使用，研缽和鑰匙經(jīng)180℃烘烤6 h后備用，采用Trizol方法提取擬南芥總RNA。

1.2.2 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

用反轉(zhuǎn)錄試劑以擬南芥RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以獲得的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR分析。RT-PCR所用引物從GenBank EST數(shù)據(jù)庫(kù)獲得片段序列信息，Primer 5設(shè)計(jì)上下游引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 使用的引物序列Tab.1 List of primer sequences

1.2.3 黃萎病菌（大麗輪枝菌）接種處理

參考李泉木等[16]的方法，將培養(yǎng)好的黃萎病菌配成孢子濃度為1×107個(gè)/mL的懸浮液。用接種針在4周大轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥子葉葉脈周圍刺傷葉片，刺15次/cm2，每個(gè)葉片接種10μL孢子懸浮液，用對(duì)照用水處理。每棵植株處理3片子葉，每一處理設(shè)置6棵植株作為重復(fù)。在22℃、光周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強(qiáng)度約為6000 lx，60%相對(duì)濕度的條件下培養(yǎng)。

1.2.4 細(xì)胞壞死染色

將接種過(guò)黃萎病菌48 h的葉片，置于DAB（1 mg/mL，pH=3.8）中染色 12 h，用比例為無(wú)水乙醇：乙酸∶甘油∶水=8∶1∶1∶1的脫色液在37℃脫色24-48 h，將葉片放在干凈的載玻片上，將Trypan blue染液均勻滴于葉面上，蓋上蓋玻片并靜置20 min，用光學(xué)顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 酶活性測(cè)定

脂肪酶活性測(cè)定：采用馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白含量，用牛血清蛋白制作6個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活性分析：反應(yīng)液中PBS pH7.0 50 mol/L，對(duì)硝基苯酚月桂酸酯1 mol/L，異丙醇5%，蛋白50 μg，37℃反應(yīng)15 min，100℃加熱2 min，冷卻至室溫后，在405 nm處測(cè)定吸光度值。

脂肪酶活力計(jì)算公式：

酶活力 =△A405×V×K×1000/（T×ε×m）(mmol/min·mg protein)。

其中，A：反應(yīng)液吸光度；V：反應(yīng)液體積（mL）；K：稀釋倍數(shù)；T：反應(yīng)時(shí)間（min）；ε=0.016(μmol/L)-1；m：蛋白含量（mg）。

采用紫外吸收法測(cè)定CAT活性，采用NBT法測(cè)定SOD活性；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性；PAL活性測(cè)定參考Southern等[17]的方法；PPO活性測(cè)定參考薛應(yīng)龍[18]的方法。

利用SPSS進(jìn)行F檢測(cè)分析各酶活性之間的差異性，利用Origin進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃萎病菌處理轉(zhuǎn)GhGLIP基因擬南芥的表型分析

用大麗輪枝菌處理轉(zhuǎn)GhGLIP基因擬南芥和野生型擬南芥植株葉片。由圖1可見(jiàn)：野生型擬南芥處理1 d后，葉片略微有些萎蔫，處理3 d后，葉片萎焉嚴(yán)重，且出現(xiàn)較多壞死斑，轉(zhuǎn)GhGLIP基因植株葉片僅產(chǎn)生少量壞死斑，無(wú)萎縮現(xiàn)象（圖1A）。用DAB-臺(tái)盼藍(lán)染色定量分析其細(xì)胞死亡情況，統(tǒng)計(jì)分析顯示，野生型擬南芥葉片細(xì)胞出現(xiàn)大面積死亡，死亡面積達(dá)59.05%；轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片細(xì)胞死亡較少，死亡面積僅11.38%（圖1B）。結(jié)果表明，GhGLIP增強(qiáng)了擬南芥對(duì)黃萎病菌的抗性。

圖1 轉(zhuǎn)GhGLIP基因擬南芥葉片對(duì)黃萎病菌處理的表型分析Fig.1 Phenotype analyses of GhGLIP transgenic Arabidopsis leaves treated by Verticillium dahlia

2.2 轉(zhuǎn)GhGLIP基因擬南芥的脂肪酶活性分析

分析結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 GDSL脂肪酶響應(yīng)黃萎病菌處理的表達(dá)分析Fig.2 The expression activity analyses of GDSL lipase responding to Verticillium dahlia

由圖2可見(jiàn)，轉(zhuǎn)GhGLIP基因擬南芥和野生型擬南芥受到黃萎病菌（大麗輪枝菌）侵染后，脂肪酶活性呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，在接菌3 d后達(dá)到最高值，而后表達(dá)逐漸趨于恒定，暗示GDSL脂肪酶與擬南芥響應(yīng)抵抗大麗輪枝菌具有密切關(guān)系。

2.3 轉(zhuǎn)GhGLIP基因擬南芥的抗氧化系統(tǒng)酶活性分析

由圖3可見(jiàn)：利用水或黃萎病菌處理后，CAT的表達(dá)變化不顯著；但是與野生型擬南芥相比，在水或黃萎病菌處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中CAT的表達(dá)均高于野生型擬南芥。

黃萎病菌處理后，POD和SOD的表達(dá)具有相似性，均受到了病菌的誘導(dǎo)表達(dá)，并且轉(zhuǎn)基因擬南芥中POD的表達(dá)高于野生型擬南芥。

圖3 黃萎病菌處理后擬南芥葉片抗氧化酶的表達(dá)分析Fig.3 Analyses of the expression activity of Arabidopsis leaves antioxidases under treatment of Verticillium dahliae

2.4 轉(zhuǎn)GhGLIP基因擬南芥中PAL和PPO的表達(dá)分析

由圖4可見(jiàn)：黃萎病菌處理1 d后，PAL受到了快速的響應(yīng)和誘導(dǎo)表達(dá)，在處理3 d后達(dá)到最高值，隨后表達(dá)趨于穩(wěn)定；轉(zhuǎn)基因擬南芥中PAL的表達(dá)高于野生型。PPO活性在黃萎病菌處理3 d后達(dá)到最高值，其響應(yīng)速度略低于PAL。這說(shuō)明PAL和PPO在擬南芥響應(yīng)病菌處理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，PAL的響應(yīng)更為快速。

圖4 黃萎病菌處理后擬南芥葉片PAL和PPO的表達(dá)分析Fig.4 The expression activity analyses of Arabidopsis leaves PAL and PPO under treatment of Verticillium dahliae

2.5 GhGLIP誘導(dǎo)病程相關(guān)基因和乙烯信號(hào)傳遞相關(guān)基因的表達(dá)

分別取接種黃萎病菌轉(zhuǎn)GhGLIP基因植株0、1、3、5、7 d后的葉片材料，以水處理為對(duì)照，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以Actin基因?yàn)閰⒄?，檢測(cè)病程相關(guān)防衛(wèi)基因和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)。與水處理的各材料相比，黃萎病菌處理轉(zhuǎn)基因植株葉片中病程相關(guān)防衛(wèi)基因PDF1.2和PR1，以及乙烯信號(hào)傳遞相關(guān)基因ERF1和EIN3基因的表達(dá)獲得了顯著的誘導(dǎo)，并且在處理1 d時(shí)有顯著增加，在處理3 d時(shí)達(dá)到最大值，隨后一直保持穩(wěn)定表達(dá)（圖5）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)GhGLIP基因擬南芥抗黃萎病菌的能力增強(qiáng)，可能與病程相關(guān)防衛(wèi)基因表達(dá)的增強(qiáng)，以及乙烯信號(hào)的作用有著密切關(guān)系。

圖5 黃萎病菌處理后防御基因和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)分析Fig.5 Expression levels of defense genes and ethylene signal transduction genes under treatment of Verticillium dahliae

3 討論

（1）植物GDSL脂肪酶能夠參與生物和非生物脅迫下的抗逆反應(yīng)。擬南芥中的一種分泌蛋白GLIP1能夠激發(fā)植物局部和系統(tǒng)的抗性，重組表達(dá)的GLIP1蛋白可以直接破壞真菌孢子的完整性，從而抑制十字花科黑斑病菌、胡蘿卜軟腐歐文氏菌和丁香假單胞菌等真菌的生長(zhǎng)繁殖。辣椒中的GDSL脂肪酶基因CaGLIP1受到脅迫因子的誘導(dǎo)表達(dá)，轉(zhuǎn)CaGLIP1基因擬南芥的GDSL脂肪酶活性顯著提高，并且對(duì)生物和非生物脅迫的抗性增強(qiáng)[9，19]。本研究將從陸地棉中獲得1個(gè)GDSL脂肪酶基因GhGLIP轉(zhuǎn)化哥倫比亞野生型擬南芥，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥植接種黃萎病菌處理，轉(zhuǎn)基因擬南芥中GDSL脂肪酶的表達(dá)受到了誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗病性顯著增強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因擬南芥中抗氧化系統(tǒng)酶如CAT、SOD和POD，以及PAL和PPO的均能快速響應(yīng)黃萎病菌處理并具有較高的誘導(dǎo)表達(dá)，表明這些酶表達(dá)在病菌響應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。

（2）植物GDSL脂肪酶響應(yīng)脅迫發(fā)揮其功能時(shí)，有時(shí)需要激素的誘導(dǎo)和調(diào)控。乙烯是誘導(dǎo)對(duì)病原物防衛(wèi)反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[20-22]。擬南芥GLIP1蛋白可通過(guò)乙烯信號(hào)的誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強(qiáng)對(duì)多種病原菌和細(xì)菌的抗性[20-21，23-24]。擬南芥GLIP2蛋白在SA、JA和ET的信號(hào)誘導(dǎo)下表達(dá)，抑制歐文氏菌的生長(zhǎng)[20]。本研究中，在黃萎病菌處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)有顯著提高，細(xì)胞內(nèi)的防御基因PDF1.2和PR1的表達(dá)也因受到誘導(dǎo)而增加，但是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)更為顯著，暗示GLIP基因和乙烯之間的關(guān)系密切，以及它們?cè)邳S萎病菌響應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。

植物的抗病響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到眾多的生理過(guò)程，本研究為抗病分子機(jī)制解析和進(jìn)一步的基因工程利用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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