歐都·吾吐那生，齊亞銀，卜三平，龔子桓，周霞

（1石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003；2巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院，庫爾勒 841000）

腸球菌是人和動物消化道內(nèi)的正常菌群。但隨著腸球菌多重耐藥菌株的出現(xiàn)使得腸球菌感染率不斷上升，可引起心內(nèi)膜炎、傷口感染、膽囊炎、腎盂腎炎、膀胱炎、腦膜炎等疾病[1]。在國內(nèi)外，近年來在人醫(yī)臨床治療和醫(yī)院中越來越受到重視，但目前在獸醫(yī)中該菌尚未引起重視[2]。自1984年獨(dú)立新菌屬以來，腸球菌種已增至41種[3]。各個種之間的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、培養(yǎng)特性差異不明顯，由于腸球菌的這些特點(diǎn)使得種的水平鑒定顯得尤為重要，而菌株的特異性在流行病學(xué)監(jiān)測方面則具有重要的價值[4]。

目前，以腸球菌基因組DNA為基礎(chǔ)已建立了多種分子生物學(xué)方法，如16S rRNA序列分析在闡明菌屬間、菌種之間親緣關(guān)系以及新菌種發(fā)現(xiàn)等方面發(fā)揮了巨大作用，利用種特異性基因探針[11]建立的PCR技術(shù)可快速準(zhǔn)確地對23種腸球菌做出準(zhǔn)確鑒定等，但由于這些方法操作煩瑣、技術(shù)要求及成本較高，不適于臨床實驗室常規(guī)應(yīng)用，只能用于腸球菌的科學(xué)研究。然而，目前在獸醫(yī)臨床中對動物糞腸球菌感染還無相應(yīng)的快速準(zhǔn)確鑒定方法。

因此，本研究采集不同動物源的糞樣，首先采用鏈球菌選擇培養(yǎng)基進(jìn)行初步篩選，然后采用tuf基因的PCR方法鑒定到腸球菌屬，最后結(jié)合分離株的生理生化特性和培養(yǎng)特性，準(zhǔn)確鑒定到種，以期建立一種快速準(zhǔn)確的鑒定糞腸球菌的方法和程序。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 糞樣來源

本試驗的樣品來源于不同動物的新鮮糞樣，肛門式無菌采集。其中羊源：96份；牛源：30份；豬源：36份；雞源:6份；馬源：26份。

1.1.2 主要儀器

光明電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；TC-512 PCR儀，北京德力萊科技發(fā)展有限公司；顯微鏡，日本OLYMPUS公司；超凈工作臺Boxun，上海博迅實業(yè)有限公司；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，杭州雷琪實驗器材有限公司；Sartorius電子天平，上海歡奧科技有限公司；Sigma離心機(jī)（1-15型）、德國SiGMA離心機(jī)公司；光明隔水式恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.1.3 主要試劑

PCR相關(guān)試劑及試劑盒購自天根生化科技有限公司和TaKaRa寶生物工程有限公司；腸球菌菌屬生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；腦心浸液肉湯購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；LB瓊脂培養(yǎng)基、鏈球菌選擇瓊脂培養(yǎng)基均自配。

1.1.4 引物

參照文獻(xiàn)[9]中已公布的tuf基因保守區(qū)域設(shè)計通用引物，上游引物為：5'-TACTGACAAACCATTCAT GATG-3'，下游引物為：5'-AACTTCGTCACCAACGCGA AC-3'，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為121 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

無菌操作，將不同動物源糞便的拭子，接種于LB肉湯、BHI肉湯，置37℃搖床增菌培養(yǎng)18-24 h。將培養(yǎng)菌液劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基、鏈球菌選擇瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)18-24 h，觀察細(xì)菌菌落形態(tài)，挑取單個菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，進(jìn)行初步篩選。再將純培養(yǎng)物接于LB斜面，37℃恒溫培養(yǎng)24 h待做進(jìn)一步鑒定。

圖1 分離株在鏈球菌選擇瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphologies of isolation on Streptococcus agar culture medium

1.2.2 分離株tuf基因?qū)俚腜CR方法檢測

細(xì)菌基因組DNA的提取采用煮沸法，即取LB肉湯或BHI肉湯培養(yǎng)18 h的分離株1 mL，12 000 r/min離心 3 min，置 100℃水浴加熱 10 min，迅速冰浴冷卻，反復(fù)凍融數(shù)分鐘，8000 r/min離心5 min，吸取上清液作為DNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。tuf基因PCR反應(yīng)體系為20μL；擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s，共 30個循環(huán)；最后延伸72℃ 10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，在1%瓊脂糖凝膠上以溴酚藍(lán)為指示劑于0.5×TBE中65 V電壓電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)分析、拍照、檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，以PCR產(chǎn)物出現(xiàn)112 bp條帶的分離株為腸球菌。

1.2.3 培養(yǎng)特性鑒定

將分離菌的純培養(yǎng)物接種于 6.5%NaCl，pH 9.5的肉湯中，分別置 10、45℃培養(yǎng)24 h，觀察其對溫度及高堿的耐受性。

1.2.4 生化特性鑒定

生化試驗參照說明書，將分離菌的純培養(yǎng)物接種于葡萄糖、棉籽糖、山梨糖、膽汁七葉苷、葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水、氨基酸脫羧酶、馬尿酸鈉、精氨酸雙水解、β-半乳糖苷（ONPG）、精氨酸脫羧酶等生化鑒定管中進(jìn)行生化試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的形態(tài)與生長特性

純培養(yǎng)的分離株在液體培養(yǎng)物中以長鏈為主，一般為革蘭氏陽性，老齡培養(yǎng)中偶見革蘭氏陰性；在BHI肉湯中可見絮狀沉淀與試管底部；在LB培養(yǎng)基上生長不良；在鏈球菌選擇瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)中的菌落呈圓形、光滑濕潤、表面略光滑，無色透明，邊緣整齊的針尖大的小菌落（圖1）。對單個菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢可見單個、成對或短鏈狀排列的革蘭陽性呈圓形或橢圓形的球菌（圖2）。

圖2 分離株菌株液體培養(yǎng)物染色形態(tài)（100×）Fig.2 Morphologies of the isolates in broth(100×)

2.2 分離株tuf基因?qū)俚腜CR檢測結(jié)果

針對腸球菌高度保守的tuf基因設(shè)計的特異性引物對分離株進(jìn)行擴(kuò)增，均能擴(kuò)能出長度為112 bp的特異性條帶（圖3），即符合腸球菌屬的分子特性，而在相同條件下擴(kuò)增鏈球菌則得不到相同的結(jié)果。因此，擴(kuò)增tuf基因的PCR方法相比其他的鑒定手段更具有準(zhǔn)確性高，費(fèi)時短的優(yōu)點(diǎn)。

圖3 腸球菌分離株tuf基因PCR電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of tuf in Enterococcus

2.3 分離株的培養(yǎng)特性鑒定結(jié)果

分離株菌能耐受10℃的低溫和45℃的高溫，可在6.5%的NaCl和pH 9.6的的LB肉湯中生長，表明分離株對低溫、高溫、高鹽和高堿具有很強(qiáng)的耐受性（表1）。該特性為腸球菌屬細(xì)菌與鏈球菌的最大區(qū)別。

表1 代表分離株的生理生化及培養(yǎng)特性結(jié)果表Tab.1 The part of biological characteristics of the isolates

2.4 分離株的生理生化特性鑒定結(jié)果

分離株的生理生化特性及培養(yǎng)特性均符合糞腸球菌種的特征，結(jié)果見表1。結(jié)合生理生化、培養(yǎng)特性結(jié)果，將不同分離株的鑒定結(jié)果與糞腸球菌的符合率超過97%的列為目標(biāo)菌，即糞腸球菌200株，包括豬源46株，雞源27株、牛源96株、羊源17株、馬源14株。結(jié)果（表2）顯示，糞腸球菌的分離率為分別為16.14%、71.05%、33.68%、5.96%、4.91%。

表2 分離株的來源及種屬關(guān)系Tab.2 Sources of isolates and the relationship among the species

3 討論

近年來，動物感染糞腸球菌的報道越來越多，造成的危害也越來越大，且其耐藥性增強(qiáng)，給臨床上治療帶來了困難，同時，耐藥基因可以通過食物鏈傳遞給人類，人和動物密切接觸還可導(dǎo)致人的發(fā)病死亡[5-6]。由于不同的腸球菌致病性和耐藥性不同，這就迫切要求對感染的腸球菌種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定。

（1）本實驗共采集不同動物源包括豬、牛、羊、雞、馬等的糞樣共194份，采用常規(guī)細(xì)菌分離方法，即用鏈球菌選擇瓊脂培養(yǎng)基從樣品中篩選出腸球菌純培養(yǎng)物。在液體培養(yǎng)物中以長鏈為主，一般為革蘭氏陽性，老齡培養(yǎng)中偶見革蘭氏陰性；在BHI肉湯中可見絮狀沉淀與試管底部；在LB培養(yǎng)基上生長不良；在鏈球菌選擇瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)中的菌落呈圓形、光滑濕潤、表面略光滑，無色透明，邊緣整齊的針尖大的小菌落。對單個菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢可見單個、成對或短鏈狀排列的革蘭陽性呈圓形或橢圓形的球菌。

（2）與表型特征鑒定方法[7-8]相比，用針對腸球菌高度保守的tuf基因PCR方法進(jìn)行特異性擴(kuò)增，結(jié)果表明有285株細(xì)菌均能擴(kuò)增出112 bp的特異性條帶,而在相同條件下擴(kuò)增鏈球菌則得不到相同的結(jié)果。由此可見，該方法的使用能有效提高腸球菌分離的準(zhǔn)確率，鑒定細(xì)菌速度快。因此，擴(kuò)增tuf基因的PCR方法[12]相比其他的鑒定手段更具有準(zhǔn)確性高，用時短的優(yōu)點(diǎn)。

（3）分離株菌能耐受10℃的低溫和45℃的高溫，可在6.5%的NaCl和pH 9.6的的LB肉湯中生長，表明分離株對低溫、高溫、高鹽和高堿具有很強(qiáng)的耐受性。該特性為腸球菌屬細(xì)菌與鏈球菌的最大區(qū)別。葡萄糖、山梨糖、和棉籽糖發(fā)酵、葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水、馬尿酸鈉、精氨酸雙水解、β-半乳糖苷（ONPG）、精氨酸脫羧酶等試驗的結(jié)果，可以將分離株與同群的其他細(xì)菌區(qū)分而鑒定為糞腸球菌[11]。本研究分離株的生理生化特性及培養(yǎng)特性均符合糞腸球菌種的特征。

糞腸球菌為人獸共患條件致病菌之一，準(zhǔn)確快速地鑒定糞樣等標(biāo)本中是否含有該菌,對于臨床治療具有積極的意義[9-10]。本研究建立的可參考方法和程序可在60 h內(nèi)完成，操作簡便，技術(shù)要求低，成本低，且特異性較高，是微生物實驗室可選擇的常規(guī)鑒定方法。

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