張燁華 ，王立民 ，王聰慧 ，趙興旺 ，丁新平 ，周平

（1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832003；2新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/新疆農(nóng)墾科學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室，石河子832000；3石河子市石總場(chǎng)畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，石河子，832000;4新疆西部牧業(yè)股份有限公司紫泥泉種羊場(chǎng),石河子 832000）

微衛(wèi)星（Microsatellites），也稱(chēng)為簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSRs）或短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeats，STRs），其作為一種分子標(biāo)記現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用于遺傳學(xué)、親緣關(guān)系、種群以及其他方面的研究。微衛(wèi)星首先由Miesfeld等[1]于1981年在人類(lèi)基因文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，隨后這種簡(jiǎn)單重復(fù)序列被Tautz等[2]證實(shí)廣泛存在于真核生物中。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比較，微衛(wèi)星標(biāo)記擁有明顯優(yōu)點(diǎn)[3]，如符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律、共顯性遺傳、遺傳性穩(wěn)定、多態(tài)性豐富等。國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展表明，微衛(wèi)星標(biāo)記現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于多物種多層次的檢測(cè)及分析，如蚌類(lèi)、魚(yú)類(lèi)；肉品質(zhì)分析、植物生態(tài)學(xué)和進(jìn)化、綿羊群體多態(tài)性、牛親子鑒定、家兔品種的遺傳變異等[4-9]。

新疆是我國(guó)綿羊品種最多、遺傳品質(zhì)最復(fù)雜的省區(qū)，在長(zhǎng)期生產(chǎn)實(shí)踐中育成了許多具有特色的地方品種[9]。藏羊[10]是中國(guó)綿羊三大系之一，具有耐寒、耐粗放飼養(yǎng)、抗病力強(qiáng)等優(yōu)良種質(zhì)特性，主要分布在青藏高原及其毗鄰的川、滇、甘等高寒地區(qū)，是具有青藏高原特色的品種資源。目前，有關(guān)藏羊遺傳多樣性方面的研究文獻(xiàn)較少，楊燕等[11]對(duì)部分藏系綿羊研究，認(rèn)為藏系綿羊各群體間親緣關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化有待進(jìn)一步研究。徐琳娜等[10]在藏系綿羊遺傳多樣性的研究進(jìn)展中表明，有關(guān)藏系綿羊遺傳特性的系統(tǒng)研究很少，需要進(jìn)一步了解。李祥龍等[12]利用微衛(wèi)星技術(shù)研究我國(guó)蒙古羊、烏珠穆沁羊、哈薩克羊、阿勒泰羊、灘羊和藏綿羊6個(gè)地方綿羊品種的研究。

本研究以新疆的地方綿羊品種（策勒黑羊、多浪羊、巴音布魯克羊、巴什拜羊及阿勒泰羊）和藏羊?yàn)檠芯繉?duì)象，探討各品種綿羊的遺傳多樣性，旨在為品種資源保護(hù)、遺傳育種工作提供參考依據(jù)；其次，研究藏羊與新疆品種之間的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)對(duì)于品種的起源進(jìn)化研究、種質(zhì)資源保護(hù)以及科學(xué)開(kāi)發(fā)利用均具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)樣本包括6個(gè)綿羊群體，均來(lái)自新疆南疆地區(qū)，共計(jì)263只，每個(gè)群體隨機(jī)采集約45只，均采用頸靜脈采血，所采血樣均為5 mL/只，EDTA抗凝，-20℃保存，用于DNA提取。各群體的樣本數(shù)量見(jiàn)表1。

表1 6個(gè)綿羊品種信息Tab.1 Information of 6 sheep breeds

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及引物合成

1）DNA的提?。河锰旄难夯蚪MDNA提取試劑盒提取;

2）根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[13]及 Genbank提供的信息先擇8個(gè)座位的引物，交由生工生物工程（上海）有限公司采用HAP方法合成。引物信息見(jiàn)表2。

3）PCR擴(kuò)增反應(yīng)：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性 30 s，53-62.8℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共33-40個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸10 min。4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

表2 8對(duì)微衛(wèi)星引物的詳細(xì)信息Tab.2 Detailed information of 8 pairs of SSRs primers

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

微衛(wèi)星等位基因數(shù)據(jù)分析軟件為Quantity One 4.6.2，用其分析所分離的微衛(wèi)星片段大小；采用Excel Microsatellite Toolkit計(jì)算等位基因頻率和等位基因大小范圍；計(jì)算多態(tài)信息含量（Polymorphic information content，PIC）、群體雜合度（Heterozygosity，He）和有效等位基因數(shù)（Effective number of alleles，Ne）；采用Mega5.2分析軟件構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果

將提取的部分基因組DNA采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰（圖1），說(shuō)明提取的 DNA在濃度、純度和質(zhì)量上均較好。

圖1 藏羊基因組DNA部分瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Part Agarose Gel Electrophoresis results of Tibetan sheep genomic DNA

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果

PCR產(chǎn)物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用快速銀染法顯色。圖2、圖3分別為微衛(wèi)星座位CMC133和AE129擴(kuò)增產(chǎn)物的部分電泳圖譜，顯示CMC133和AE129微衛(wèi)星座位在不同個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。由圖2、圖3可知，同一微衛(wèi)星座位對(duì)不同個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物不同，說(shuō)明存在多態(tài)性。

圖2 策勒黑羊在微衛(wèi)星位點(diǎn)CMC133的部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.2 A portion of PCR results of CMC133 in Cele sheep

圖3 多浪羊在微衛(wèi)星位點(diǎn)AE129的部分?jǐn)U增結(jié)果Fig.3 A portion of PCR results of AE129 in Duolang sheep

2.3 等位基因變異分析

通過(guò)對(duì)6個(gè)綿羊群體263只個(gè)體8個(gè)微衛(wèi)星座位的PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)130個(gè)等位基因。各微衛(wèi)星座位等位基因的分布（表3）顯示，在座位OarFCB304上發(fā)現(xiàn)的等位基因數(shù)較多，為20個(gè)，在座位MCM133上發(fā)現(xiàn)的等位基因數(shù)較少，為10個(gè)。等位基因的變異范圍為2-38 bp，以座位OarFCB304上的變異范圍最大。

表3 不同微衛(wèi)星座位的等位基因Tab.3 Alleles of different microsatellite loci

2.4 遺傳多樣性分析

表4顯示了6個(gè)綿羊品種中8個(gè)微衛(wèi)星座位的平均PIC、He以及Ne，其中藏羊在PIC與He中最高，分別為0.8715和0.8922，在巴音布魯克中最低分別為0.8350和0.8629；Ne在巴什拜羊群體中最高為9.8722，其次是藏羊群體為9.5361，最低的是巴音布魯克群體為7.6882。由表4可見(jiàn)，6個(gè)綿羊品種中藏羊和巴什拜羊的遺傳多樣性較豐富，巴音布魯克羊遺傳多樣性相對(duì)較低。

表4 6個(gè)綿羊群體中8個(gè)微衛(wèi)星座位的PIC、He和NeTab.4 PIC，He，Ne of 8 microsatalfite locus in 6 sheep groups

2.5 遺傳距離及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

由圖4可知，策勒黑羊與巴什拜羊聚為一類(lèi)，巴音布魯克羊與藏羊先聚為一類(lèi)，然后與阿勒泰羊聚在一起。由表5可知，藏羊和策勒黑遺傳距離最遠(yuǎn)為0.79，巴什拜羊與多浪遺傳距離最近為0.26。

圖4 6個(gè)綿羊群體NJ方法聚類(lèi)Fig.4 The dendrogram of Neighbor-joining(NJ)method in 6 sheep groups

表5 6個(gè)綿羊群體間的遺傳距離Tab.5 Genetic distances between breeds of six sheep

3 討論

（1）本試驗(yàn)所選的綿羊8個(gè)微衛(wèi)星座位，分別位于8條不同的染色體上，可最大限度地提供遺傳信息。8個(gè)微衛(wèi)星座位共檢測(cè)到130個(gè)等位基因，平均等位基因大小為16.25 bp，其中最高的Ne是OarFCB304，為 20個(gè)，而 OarFCB48、BMS1004和SRCRSP9最低，為16個(gè)。因?yàn)橐话氵x擇Ne在5-19個(gè)為宜，這是因?yàn)镹e太少，不能提供足夠的信息量，所以本研究選取8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。

（2）PIC能夠反映微衛(wèi)星片段多態(tài)性。Botstein等[14]]最早提出采用PIC衡量基因變異程度：當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)；0.25＜PIC＜0.5時(shí)為中度多態(tài)性位點(diǎn)；PIC＜0.25時(shí)為低度多態(tài)位點(diǎn)。在檢測(cè)的8個(gè)微衛(wèi)星座位中，巴音布魯克的PIC最低，為0.8356。5個(gè)群體的PIC均大于0.5，表明這些群體均呈高度多態(tài)，適宜用于綿羊品種間遺傳多樣性分析，同時(shí)也表明本研究群體提供的遺傳信息較高，具有較大的利用潛力。8個(gè)微衛(wèi)星座位使6個(gè)品種綿羊之間存在差異，如巴什拜羊的多態(tài)信息含量0.8664，而策勒黑羊?yàn)?.8618，這種差異可能是綿羊品種在長(zhǎng)期的自然和人工選擇過(guò)程造成的。

（3）He反映各群體在多個(gè)位點(diǎn)上的遺傳變異，被認(rèn)為是度量群體遺傳變異的1個(gè)最適參數(shù)就相同的分子標(biāo)記而言，He的高低反映了群體的遺傳一致性程度。He越低，表明該群體的遺傳一致性越高，而群體的遺傳變異越少，群體遺傳多樣性越低[15]，反之，則多樣性越高。本實(shí)驗(yàn)用8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)6個(gè)肉用綿羊品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，得出6個(gè)綿羊品種He 0.8629-0.8922，高于賈斌等[16]在新疆8個(gè)綿羊品種遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的微衛(wèi)星分析研究結(jié)果（He為0.5306-0.6224），也高于湯存?zhèn)17]在新疆13個(gè)綿羊品種遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析研究結(jié)果（其He 0.6754-0.7530），這說(shuō)明其原因一方面與選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)有關(guān)，另一方面說(shuō)明所選的6個(gè)綿羊品種具有豐富的遺傳變異。

（4）群體聚類(lèi)分析能直觀反映親緣的遠(yuǎn)近，策勒黑羊與巴什拜羊聚為一類(lèi)，這與閏景娟等[19]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果將巴音布魯克羊與藏羊先聚為一類(lèi)，然后與阿勒泰羊聚在一起，這與楊燕等[11]的研究結(jié)果一致。而新疆當(dāng)?shù)厝嗣駥⒍嗬搜虬旬?dāng)?shù)氐耐练N羊，在本品種選育基礎(chǔ)上，從塔什庫(kù)爾干引入的半粗毛羊，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期繁育而成。符合地理分布。

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