姚佳茗 ，曹文疆 ，袁勇 ，洪葉 ，陳衛(wèi)軍 ，王新春 ,

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，石河子 832008）

心血管疾病是威脅人類健康的主要疾病之一[1]。近年來，心肌缺血-再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）已受到廣大基礎(chǔ)和臨床工作者的關(guān)注[2-4]。造成MIRI的機制有許多，其中線粒體作為氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的重要細胞器與MIRI的各個環(huán)節(jié)都有密切關(guān)系[5-7]。

香青蘭（Dracocephalum Moldevica L.）為唇形科青蘭屬一年生草本植物[8]，是維吾爾民族藥之一，主要用于治療心肌缺血、冠心病等心血管疾病[9-10]。其主要化學(xué)成分有黃酮類、揮發(fā)油、萜類、氨基酸及多肽等[11]，黃酮是香青蘭的主要有效成分[12]。香青蘭總黃酮（Dracocephalum Moldavica L.total flavonoids，TFDM）對缺血心肌有保護作用，但其作用是否與線粒體保護作用密切相關(guān)。本實驗通過對TFDM抗MIRI線粒體保護作用的研究，為香青蘭臨床治療心血管疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

HX-100E小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；TGL-16H臺式高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；Thermo Scientific Varioskan Flash 3001酶標(biāo)儀（USA）；UV-2401PC紫外分光光度計（日本島津），JEOL-JEM-1230型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；EM-UC6型超薄切片機（美國Leica公司）。

1.2 試藥

香青蘭總黃酮提取物（新疆自治區(qū)藥物研究所提供，香青蘭總黃酮純度為57%，20100708）；復(fù)方丹參滴丸（天津天士力制藥股份有限公司，950411）；環(huán)孢素 A（Sigma，BCBG7884V）；線粒體 /胞漿制備試劑盒（普利萊基因技術(shù)有限公司 C1260）；BCA法微量蛋白檢測試劑盒（南京建成，W 041）；ATP含量測定試劑盒（南京建成，A095）；MTT（Thermo scientific）；DCFH-DA（Sigma，D6883）Evans Blue（Sigma，502A043）；TTC（Sigma，531D036）

1.3 動物

雄性SD大鼠，體重200-300 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。合格證號：新醫(yī)動字第2003-0001號。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組及給藥

SD大鼠雄性，隨機分為7組，每組10只：假手術(shù)組（Sham）；心肌缺血 -再灌注組（模型組，I/R）；香青蘭總黃酮低劑量藥物組（TFDM-L，15 mg/kg/d），香青蘭總黃酮中劑量藥物組（TFDM-M，30 mg/kg/d），香青蘭總黃酮高劑量藥物組（TFDM-H，60 mg/kg/d）；環(huán)孢素 A組（CsA，再灌前 20 min經(jīng)尾靜脈注射10 mg/kg）；復(fù)方丹參滴丸陽性藥對照組（CSDP，243 mg/kg/d）。各給藥組灌胃給藥 7 d，對照組和模型組同時用生理鹽水灌胃，并于第8天給藥后10 min行手術(shù)。

1.4.2 大鼠冠脈結(jié)扎（LAD結(jié)扎）致心肌缺血-再灌注模型的建立[13-14]

大鼠腹腔注射25%的烏拉坦（0.5 mL/100 g）麻醉。仰臥位固定，連接BL-420E生物機能實驗系統(tǒng)，監(jiān)測正常狀態(tài)下大鼠肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖。行氣管插管，切開皮膚，鈍性分離胸肌至肋骨，從第四五肋間隙把胸腔撐開，接呼吸機，切除第五肋。撕開心包膜，暴露心臟，輕輕取出心臟結(jié)扎左冠狀動脈前降支（LAD），觀測心電圖，以心電圖 S-T段抬高、T波高聳或弓背向上抬高為心肌缺血模型復(fù)制成功的標(biāo)志。缺血30 min后，掏出心臟，剪開結(jié)扎線，將其放回胸腔。此時以ST段抬高下降，T波逐漸恢復(fù)測定表示再灌注成功，120 min后進行取材和相應(yīng)指標(biāo)的測定。

1.4.3 心肌梗死面積的測定

采用Evans Blue-TTC雙重染色法計算法分析梗死面積。再灌注120 min后，再次阻斷LAD，從主動脈逆行注射1%伊文氏藍，沖洗心臟，左心室切片，1%TTC磷酸緩沖液中避光，37℃恒溫孵育30 min。計算缺血面積百分比（AAR/LV）=（缺血面積/左心室面積）×100%。梗死面積百分比（IS/AAR）=（梗死面積/缺血面積）×100%。

1.4.4 心肌組織ATP含量檢測

按試劑盒說明書配置工作液并嚴(yán)格操作。工作液及待測樣品加完后室溫靜置5 min，在636 nm處測吸光度值。

1.4.5 線粒體的制備

100-200mg心肌新鮮組織，剪碎加入預(yù)冷的Mito Solution研磨。將勻漿液800×g離心5 min 4℃。收集上清液，重復(fù)上一步驟。上清液10，000×g離心10 min 4℃，沉淀加入0.2 mL Mito Solution，12，000×g離心10 min 4℃。線粒體沉淀在管底并立即使用。

1.4.6 電鏡標(biāo)本制備

樣品于2%的戊二醛液固定24 h以上，經(jīng)0.1%磷酸緩沖液漂洗，1%鋨酸固定，再用磷酸緩沖液沖洗。用 50%、60%、70%、90%丙酮脫水各 15 min，100%丙酮脫水10 min，兩次。用環(huán)氧樹脂812包埋劑進行常規(guī)包埋，在37℃溫箱中過夜，于45℃溫箱中放置12 h，60℃放置24 h。超薄切片，硝酸鉛-醋酸雙氧鈾電子染色，JEOL-1230透射電鏡下觀察。

1.4.7 BCA法測定蛋白濃度

心肌線粒體蛋白含量的測定采用BCA蛋白定量檢測法。按試劑盒說明書配置工作液。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成不同濃度，按說明書要求加入試劑，旋渦混合。37℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀在562 nm波長處讀取吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。調(diào)節(jié)樣本蛋白濃度至0.5 mg/mL。

1.4.8 線粒體活力檢測

取新鮮制備的線粒體懸液50μL，加入酶標(biāo)板微孔中，加入5 g/L甲氮甲唑藍20μL，30℃繼續(xù)孵育30 min，再加入50μL異丙醇20 min后于酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm比色。線粒體活力以加入MTT后OD570表示。

1.4.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理試驗數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）的形式表達，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）及t檢驗，P＜0.01、P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 TFDM對心肌梗死面積的影響

除假手術(shù)組，各缺血-再灌注組心肌AAR/LV無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且比值均>30%，證明模型建立成功。與假手術(shù)組比較，模型組IS/AAR明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，香青蘭高、中劑量組均可以顯著降低心肌梗塞面積（P<0.01）。丹參滴丸組及mPTP抑制劑環(huán)孢素A組心肌梗死面積亦有所下調(diào)（表1）。

表1 香青蘭總黃酮預(yù)處理對大鼠MIRI后心肌及線粒體的保護作用 ±S,n=10Tab.1 Protection of TFDM on myocardia in MIRI rats ±S,n=10

表1 香青蘭總黃酮預(yù)處理對大鼠MIRI后心肌及線粒體的保護作用 ±S,n=10Tab.1 Protection of TFDM on myocardia in MIRI rats ±S,n=10

注：與假手術(shù)組比較，++表示P＜0.01；與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與環(huán)孢素A組相比較，＃表示P＜0.05。

假手術(shù)組 0 01733.89±351.10 0.74±0.15

2.2 TFDM對心肌組織ATP含量的影響

結(jié)果見表1，與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織ATP含量明顯下降（P＜0.01），說明缺血再灌后線粒體受損，ATP含量降低。與模型組相比，香青蘭總黃酮高劑量組、環(huán)孢素A組和丹參滴丸組能夠明顯提高心肌組織ATP含量（P＜0.01）；與環(huán)孢素A組比較，香青蘭總黃酮低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），其保護作用低于環(huán)孢素A組，中、高劑量組以及復(fù)方丹參滴丸組與環(huán)孢素A組比較沒有顯著性差異，說明三者對心肌組織ATP含量的影響與環(huán)孢素A相似。

2.3 TFDM對線粒體微觀結(jié)構(gòu)的改變

如圖1所示，假手術(shù)組（圖1a）線粒體外膜光滑，內(nèi)膜褶皺呈嵴，嵴形狀規(guī)則，線粒體光密度居中。模型組（圖1b）線粒體明顯腫脹，嵴突紊亂、斷裂或消失，空泡樣變甚至溶解至無正常結(jié)構(gòu)。香青蘭總黃酮高劑量組（圖1e）、環(huán)孢素A組（圖1f）以及復(fù)方丹參滴丸組（圖1g）線粒體輕度腫脹，基質(zhì)基本完整，顆粒部分消失，少部分?jǐn)嗔?，較I/R組比線粒體損傷程度明顯減輕。香青蘭總黃酮低劑組（圖1c）超微結(jié)構(gòu)改變與I/R組相似，病變稍輕，中劑量組（圖1d）較之低劑量組線粒體形態(tài)有所好轉(zhuǎn)（圖1 a-g）。

圖 1 透射電鏡下觀察心肌線粒體的結(jié)構(gòu)改變（×20000）Fig.1 Effect of TFDM on ultrastructure of mitochondria（×20000）

2.4 TFDM對線粒體活力的影響

結(jié)果見表1、圖2，與假手術(shù)組相比，模型組線粒體活力明顯下降（P＜0.01），說明缺血再灌后線粒體受損，活力減低。與模型組相比，香青蘭總黃酮中劑量組與丹參滴丸組線粒體活力下降幅度較小（P＜0.05），香青蘭總黃酮高劑量組和環(huán)孢素A組能夠明顯抑制線粒體活力的降低（P＜0.01），起到保護線粒體的作用。各給藥組除香青蘭總黃酮低劑量組外，與環(huán)孢素A組相比沒有明顯差異。

圖2 香青蘭總黃酮預(yù)處理對大鼠線粒體活力的影響（±s，n=10）Fig.2 Effect of TFDM on Activity of mitochondria(±s，n=10)

3 討論

能量是心肌缺血-再灌注過程中保持心肌細胞結(jié)構(gòu)完整，維持正常功能的重要保障。線粒體功能障礙在心肌缺血-再灌注損傷（MIRI）中占有重要地位。缺血-再灌注時線粒體極易受到損傷，并在整個病理過程中起著中心樞紐作用。環(huán)孢素A（CsA）是一種特異性線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放抑制劑，大量實驗證明[15]，再灌注時給予CsA，對缺血再灌過程中的心肌，尤其是線粒體，具有保護作用。故本實驗選擇了CsA、復(fù)方丹參滴丸為陽性藥物：通過復(fù)方丹參滴丸與香青蘭總黃酮和CsA的實驗結(jié)果對比，證明香青蘭總黃酮和CsA對缺血心肌有保護作用；通過線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的抑制劑CsA預(yù)處理組，和香青蘭總黃酮預(yù)處理組的實驗結(jié)果作對比，證明香青蘭總黃酮對缺血心肌的保護作用可能與保護線粒體功能有關(guān)，來評價TFDM在線粒體方面對MIRI的保護作用。

再灌注在改善心肌供血的同時又加重了單純心肌缺血所造成的損傷，可致心肌梗死的出現(xiàn)。本實驗結(jié)果表明，與模型組比較，TFDM組能顯著降低梗死面積百分比，有效的保障心臟功能的恢復(fù)。CsA預(yù)處理組與復(fù)方丹參滴丸組對缺血心肌的保護作用相當(dāng)，驗證了CsA的心肌保護作用。眾所周知，線粒體是產(chǎn)生ATP的主要場所[16]，但在缺氧缺血等病理狀態(tài)下線粒體氧化磷酸化受損，ATP合成不足，能量代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致心肌組織損害。為了評估線粒體產(chǎn)生ATP的能力，本研究檢測了各組大鼠在缺血/再灌注后心肌組織中ATP的含量。實驗結(jié)果顯示，香青蘭總黃酮各劑量組能在一定程度上抑制心肌組織ATP含量的降低，說明香青蘭總黃酮可以緩解急性心肌缺血/再灌注損傷所造成的能量供應(yīng)障礙。CsA預(yù)處理可以提高心肌組織中的ATP含量，香青蘭總黃酮中、高劑量組與環(huán)孢素A組作用相當(dāng)，提示香青蘭黃酮對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用與線粒體保護相關(guān)。

我們利用超薄切片技術(shù)，對香青蘭總黃酮預(yù)處理后的MIRI大鼠線粒體的超微結(jié)構(gòu)進行深入的研究。與假手術(shù)組比較，模型組線粒體的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的病變，表明心肌缺血再灌注后線粒體受損，其正常的生理功能嚴(yán)重退化。與模型組比較，復(fù)方丹參滴丸組以及CsA組線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變不大，可以維持正常的生理功能，其中CsA組對線粒體的保護作用優(yōu)于復(fù)方丹參滴丸組，證實了CsA的線粒體保護作用。香青蘭總黃酮高、中劑量對線粒體有明顯的保護作用。與CsA組比較，香青蘭總黃酮高劑量組、復(fù)方丹參滴丸組對線粒體的保護作用與其大致相似。表明TFDM在MIRI過程中對線粒體有一定的保護作用。

目前常用 MTT法檢測細胞的活性，代表線粒體中琥珀酸脫氫酶活性，反應(yīng)細胞線粒體活力。由實驗結(jié)果可知，缺血再灌后線粒體受損，經(jīng)TFDM預(yù)處理的組別線粒體受損程度均有所改善，表明TFDM對線粒體起到了一定的保護作用。與環(huán)孢素A組相比，香青蘭黃酮中、高劑量組和復(fù)方丹參滴丸組沒有顯著性差異，提示香青蘭黃酮可以很好的提高線粒體的活性，維持線粒體正常的生理功能。

綜上所述，TFDM不僅能夠明顯減輕大鼠心肌梗死程度，提高心肌ATP含量，還能有效保護線粒體活性以及結(jié)構(gòu)的完整性。TFDM各劑量組與CsA組和復(fù)方丹參滴丸組相比，除低劑量組外，沒有統(tǒng)計學(xué)差異，說明TFDM對MIRI具有線粒體保護作用，這可能是TFDM防治MIRI的作用機制之一。

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