李子杰，賀貝貝，高曉冬

(江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

醛縮酶介導(dǎo)的羥醛縮合反應(yīng)是合成手性C-C鍵的最重要方法之一［1-3］。對于醛縮酶來說，磷酸二羥基丙酮(DHAP)依賴型醛縮酶研究最為廣泛。該類醛縮酶催化DHAP供體分子與醛受體分子的羥醛縮合反應(yīng)，醛縮酶能夠決定產(chǎn)物中兩個新生成的立體中心的構(gòu)型［4］，并且不受底物的結(jié)構(gòu)或立體化學的影響［5］。D-果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(FruA)活性高、能夠以多種醛作為受體，是應(yīng)用最為廣泛的DHAP依賴型醛縮酶。FruA對DHAP分子的專一性要求非常高［6］，由于DHAP成本昂貴并且穩(wěn)定性較差，不利于產(chǎn)物的大量制備［6-8］。

在前期工作中，基于“一釜四酶法”的策略，以外消旋的DL-3-磷酸甘油作為起始底物在磷酸甘油氧化酶的作用下生成DHAP，同時與FruAS.car醛縮酶(Staphylococcus carnosus來源)催化的羥醛縮合反應(yīng)偶聯(lián)，制備了多種酮糖［9］。雖然能夠避免直接使用DHAP，在一定程度上節(jié)約了成本，但沒能從根本上實現(xiàn)DHAP的大量合成問題。在本研究中，以便宜的底物葡萄糖作為碳源，通過糖酵解途徑在同時表達FruAS.car醛縮酶和YqaB磷酸酶大腸桿菌工程菌胞內(nèi)產(chǎn)生DHAP，并分別在培養(yǎng)基中添加醛受體丙醛、丁醛合成相應(yīng)的稀有酮糖。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

CDFDuet-1質(zhì)粒和大腸桿菌BL21Star(DE3)，Novagen公司;pKK-fda質(zhì)粒由Fessner教授提供;大腸桿菌MG1655和DH5α本實驗室保存;用于基因擴增的引物在上海生工合成(表1)。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 酶、試劑和培養(yǎng)基

DNA聚合酶從Invitrogen公司購買;限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購于寶生物公司;鏈霉素、M9無機鹽、鹽酸硫胺素購自 Sigma-Aldrich;硅膠購自 EMD Chemicals公司。

LB液體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，121℃濕熱滅菌20 min;M9培養(yǎng)基(g/L):Na2HPO46，KH2PO43，NaCl 0.5，NH4Cl 1，MgSO40.12，CaCl20.011 1，硫胺素0.001，ZnSO40.003 2。

1.3 CDF-fda-yqaB重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pKKfda為模板，使用CDF-fda-F和CDF-fda-R分別作為上下游引物通過PCR擴增基因fda;以大腸桿菌MG1655為模板，以CDF-yqaB-F和CDF-yqaB-R分別作為上下游引物擴增基因yqaB;使用限制性內(nèi)切酶BamHI，PstI分別對fda基因片段和CDFDuet-1質(zhì)粒進行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化DH5α，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，得到重組質(zhì)粒CDF-fda;使用限制性內(nèi)切酶NdeI，XhoI分別對yqaB片段以及質(zhì)粒CDF-fda進行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽性轉(zhuǎn)化子，得到重組質(zhì)粒CDF-fda-yqaB。

1.4 稀有酮糖的制備

表達質(zhì)粒CDF-fda-yqaB轉(zhuǎn)化BL21Star(DE3)感受態(tài)細胞得到BL21Star(DE3)/CDF-fda-yqaB重組菌株。將LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的該重組菌株的培養(yǎng)液以1∶50的比例轉(zhuǎn)接到以5 g/L葡萄糖為碳源、鏈霉素終濃度為100 μg/mL的M9培養(yǎng)基中(2 L)，在37℃，225 r/min條件下培養(yǎng)。當測得菌液OD600為0.8～1.0時，調(diào)整溫度為30℃后，加入過濾滅菌終濃度為1 mmol/L的IPTG。IPTG誘導(dǎo)蛋白表達2-3 h后，加入終濃度為30 mmol/L丙醛(過濾除菌)。在發(fā)酵過程中，當葡萄糖或丙醛的量不足時，適當補加，并用NaOH溶液來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，使其維持在7.0左右。當在培養(yǎng)基中添加丁醛作為醛受體(加入丁醛的終濃度為40 mmol/L)，發(fā)酵流程參考丙醛為醛受體的發(fā)酵。當產(chǎn)物的量沒有顯著增加時，結(jié)束發(fā)酵，整個發(fā)酵過程約為40 h。

1.5 稀有酮糖的分離和純化

發(fā)酵結(jié)束后對發(fā)酵液進行離心(4 000 g，20 min，4℃)，將上清液轉(zhuǎn)移到燒瓶中進行減壓濃縮。濃縮產(chǎn)物用硅膠純化，流動相為二氯甲烷∶甲醇為20∶1(v/v)，流出液按照先后順序進行依次收集，首先初步判定目的產(chǎn)物位于哪些離心管中，然后以二氯甲烷∶甲醇20∶1(v/v)為展開劑并以體外合成的相應(yīng)酮糖產(chǎn)物作為對照，通過TLC檢測來確定含有目的產(chǎn)物的洗脫液。收集目標洗脫液，濃縮、干燥、稱重，用1H-NMR檢測純度。

1.6 同位素標記實驗

將過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液以1/50的比例轉(zhuǎn)接到以5 g/L13C全標記葡萄糖作為碳源，鏈霉素終濃度為100 μg/mL的M9培養(yǎng)基中(100 mL)。整個發(fā)酵過程參照1.4。當葡萄糖利用完全且產(chǎn)物的量沒有顯著變化時終止發(fā)酵。產(chǎn)物的分離純化參照1.5，并用13C NMR檢測。

1.7 分析方法

HPLC檢測條件如下:色譜柱型號為 Bio-Rad HPX-87H(300 mm×7.8 mm，氫型陽離子交換柱)，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，柱溫為60℃，示差檢測器檢測。

2 結(jié)果和討論

2.1 構(gòu)建重組表達質(zhì)粒CDF-fda-yqaB

首先驗證重組質(zhì)粒CDF-fda是否構(gòu)建成功，通過BamHI，PstI雙酶切能夠檢測到fda基因(888 bp)大小的片段(圖1-a)，表明fda基因片段已經(jīng)插入到CDFDuet-1質(zhì)粒中并對fda基因進行測序。為了驗證表達質(zhì)粒CDF-fda-yqaB是否構(gòu)建成功，經(jīng)過BamHI，XhoI雙酶切能夠檢測到大約1 600 bp大小的片段(圖1-b)，根據(jù)基因fda和yqaB的大小，可以推斷yqaB基因已經(jīng)成功插入到質(zhì)粒CDF-fda并進一步對yqaB基因進行測序。

圖1 重組質(zhì)粒CDF-fda-yqaB的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant plasmid CDF-fda-yqaB

2.2 醛縮酶FruAS.car和磷酸酶YqaB在大腸桿菌中的表達

使用重組表達質(zhì)粒CDF-fda-yqaB在大腸桿菌BL21Star(DE3)同時過量表達醛縮酶FruAS.car和磷酸酶YqaB。理論上，F(xiàn)ruAS.car和YqaB蛋白的分子質(zhì)量分別為32.855 kDa和20.78 kDa。從SDS-PAGE圖來看(圖2)，這兩種蛋白的大小基本上與理論值一致，從而說明醛縮酶FruAS.car和磷酸酶YqaB成功得到了表達。

2.3 以丙醛(丁醛)為醛受體發(fā)酵制備稀有酮糖

圖2 SDS-PAGE檢測FruAS.car和YqaB的表達Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression of FruAS.carand YqaB

在前期體外實驗中，利用醛縮酶FruAS.car分別以丙醛、丁醛等受體合成了D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖、D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖等稀有酮糖［9］。在體外實驗中，酸性磷酸酶(AP)常用來脫磷酸化得到相應(yīng)酮糖［9］，由于AP的最適pH偏酸性，不適合在大腸桿菌細胞內(nèi)的脫磷酸化。通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)來源于大腸桿菌的磷酸酶YqaB在中性pH(生理條件下)具有較強的磷酸酶活性［10］。首先在體外實驗中研究YqaB磷酸酶對底物D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖-1-磷酸和 D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖 1-磷酸的脫磷酸化作用，通過TLC檢測發(fā)現(xiàn)該磷酸酶可以脫掉相應(yīng)酮糖-1-磷酸的磷酸基團得到相應(yīng)的酮糖(未顯示結(jié)果)。為了在大腸桿菌合成如上兩種稀有酮糖，以BL21Star(DE3)/CDF-fda-yqaB作為發(fā)酵菌株，以廉價的葡萄糖作為碳源，分別在培養(yǎng)基中添加丙醛、丁醛作為醛受體，進行相應(yīng)酮糖的合成。為了檢測是否有目標酮糖產(chǎn)物的生成，對發(fā)酵液上清進行HPLC檢測，并分別以體外合成純化的兩種稀有酮糖作為對照。由圖3可以看到，D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖能夠被檢測到(如箭頭所示);由圖4可以看到，D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖能夠被檢測到(如箭頭所示)。從而說明分別以丙醛、丁醛為受體，能夠分別在大腸桿菌中合成相應(yīng)的稀有酮糖。

當在培養(yǎng)基中添加丙醛作為醛受體，對于2 L的發(fā)酵，發(fā)酵上清液經(jīng)過硅膠純化，能夠制備D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖(300 mg);當在培養(yǎng)基中添加丁醛作為醛受體(2 L)，發(fā)酵液經(jīng)過純化，能夠制備D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖(321 mg)。純化后的酮糖產(chǎn)物用1H NMR進行確認，如圖5所示?？傮w上來說，以丙醛、丁醛為醛受體的發(fā)酵，分離純化后得到相應(yīng)稀有酮糖的產(chǎn)量比較低，分析其可能的原因如下:由FruAS.car醛縮酶體外合成實驗可以推斷，和D-甘油醛相比，F(xiàn)ruAS.car醛縮酶對丙醛、丁醛的活性比較低;YqaB磷酸酶對D-果糖-1-磷酸具有較高的磷酸酶活性，而對 D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖-1-磷酸和 D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖-1-磷酸脫磷酸基團的活性比較低;丙醛、丁醛對大腸桿菌菌體生長具有抑制作用。為了提高產(chǎn)量，一方面對調(diào)節(jié)DHAP合成的上游基因過量表達，同時敲除DHAP的代謝支路在胞內(nèi)積累DHAP的量;另一方面對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，比如優(yōu)化丙醛、丁醛加入的量等。

圖3 HPLC檢測在大腸桿菌中合成D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖Fig.3 HPLC analysis of the production of 5，6-dideoxy-D-threo-2-hexulose in E.coli

圖4 HPLC檢測在大腸桿菌中合成D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖Fig.4 HPLC analysis of the production of 5，6，7-trideoxy-D-threo-heptulose

2.4 同位素標記實驗

經(jīng)過羥醛縮合反應(yīng)得到的稀有酮糖包含兩部分，第1，2，3位的碳原子來源于供體DHAP，其余碳原子來源于醛受體。為了證實產(chǎn)物從DHAP而來的3個碳原子最終從葡萄糖而來，以BL21Star(DE3)/CDF-fda-yqaB作為工程菌，以13C同位素全標記的葡萄糖作為唯一碳源并在培養(yǎng)基中添加丙醛進行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過分離純化得到 D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖(25 mg)。通過對酮糖產(chǎn)物進行13C NMR分析檢測，可以得知產(chǎn)物的1位碳對應(yīng)著位于65 ppm位置的峰，產(chǎn)物的2位碳對應(yīng)著位于210 ppm位置的峰，產(chǎn)物的3位碳對應(yīng)著76 ppm位置的峰(圖6)，從而證明推斷。

圖5 純化后產(chǎn)物1H NMR鑒定Fig.5 Characterization of products afterpurification by1H NMR

圖6 13C NMR分析同位素標記的產(chǎn)物Fig.6 13C NMR analysis of the product from the isotope experiment

3 結(jié)論

以過量表達FruAS.car醛縮酶和YqaB磷酸酶的大腸桿菌工程菌作為發(fā)酵菌株，以便宜的葡萄糖為碳源，通過糖酵解途徑在胞內(nèi)產(chǎn)生DHAP，分別在培養(yǎng)基中添加丙醛或丁醛作為受體，進行了相應(yīng)稀有酮糖D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖和 D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖的合成，從而成功地將FruA醛縮酶催化的羥醛縮合反應(yīng)在大腸桿菌中實現(xiàn)。具有重要意義的是在磷酸酶YqaB作用下，羥醛縮合產(chǎn)物能夠在胞內(nèi)實現(xiàn)脫磷酸生成沒有磷酸基團的酮糖，有利于產(chǎn)物穿過細胞膜進入到胞外，便于分離和純化，同時實現(xiàn)了磷酸基團在胞內(nèi)的再次利用。然而由于酮糖產(chǎn)量相對較低，擬采用分子生物學的方法提高胞內(nèi)DHAP水平和優(yōu)化發(fā)酵條件來提高產(chǎn)量。此外，同位素標記實驗證實了酮糖產(chǎn)物從DHAP而來的3個碳原子最終是從葡萄糖而來。

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