葛含靜

(陜西學(xué)前師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，陜西 西安，710100)

葡萄酒中的芳香物質(zhì)有上千種成分，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味有著非常重要的作用，是決定葡萄酒質(zhì)量的重要因素之一［1-2］。其中，有400多種香氣成分是由酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的［3］。在葡萄酒的釀造過(guò)程中，酵母菌利用葡萄中的糖類進(jìn)行代謝作用，生成酒精，同時(shí)形成許多風(fēng)味物質(zhì)，即形成葡萄酒特殊的發(fā)酵香氣。在參與葡萄酒釀造的多種酵母菌中，釀酒酵母(S.cerevisiae)最為重要［4］。在葡萄酒釀造的中期和后期，釀酒酵母大量存在，是葡萄酒釀造過(guò)程中的主要微生物，可修正酒精發(fā)酵過(guò)程中的香氣成分，還可產(chǎn)生特殊的發(fā)酵香氣［5］。不同的葡萄酒在發(fā)酵過(guò)程中接種的釀酒酵母不同，因而代謝途徑會(huì)有或多或少的差異，發(fā)酵香氣也會(huì)不同，從而使葡萄酒具有各自獨(dú)特的香氣特征［6-7］。葡萄酒原始的自然發(fā)酵是直接利用附著在葡萄果實(shí)上的酵母進(jìn)行發(fā)酵，在此過(guò)程中，該地區(qū)特有的微生物菌群也參與了發(fā)酵，賦予葡萄酒特有的風(fēng)味［8］。但自然發(fā)酵釀制的葡萄酒品質(zhì)不穩(wěn)定，各年份各批次之間差異較大［9］。于是，為了得到品質(zhì)穩(wěn)定的葡萄酒產(chǎn)品，目前，許多葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)大量使用進(jìn)口活性釀酒酵母，這樣雖然使葡萄酒的發(fā)酵速率和產(chǎn)品風(fēng)味得以穩(wěn)定，但卻大大降低了本土釀酒酵母對(duì)葡萄酒香氣成分的貢獻(xiàn)，導(dǎo)致我國(guó)葡萄酒在品種和風(fēng)格上較為單一，品質(zhì)同質(zhì)化嚴(yán)重，地域特色不突出［10-12］。本土酵母適應(yīng)產(chǎn)區(qū)當(dāng)?shù)氐奈h(huán)境，易于在葡萄酒發(fā)酵中占主導(dǎo)地位，還可以保證產(chǎn)區(qū)的典型特色［9，13］。因此，研究本土酵母的分離及其發(fā)酵特性對(duì)釀造具有地域特色的葡萄酒意義重大。

西安地區(qū)具有規(guī)?；钠咸逊N植基地，蘊(yùn)藏著豐富的本土酵母資源。戶太八號(hào)葡萄是西安地區(qū)特有的葡萄品種。通過(guò)對(duì)其自然發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母發(fā)酵特性的研究及酒樣品質(zhì)的分析，選育出優(yōu)勢(shì)釀酒酵母菌種，從而為生產(chǎn)具有本土特色的葡萄酒提供良好的菌種保證。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2014年9月中旬從西安市白鹿原葡萄產(chǎn)區(qū)采集成熟的戶太八號(hào)葡萄果實(shí)，自然釀造制酒。商品釀酒酵母EC1118。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基［8］:葡萄糖50 g/L，(NH4)2SO42 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，酵母膏0.5 g/L，滅菌后加Na2SO30.03 g/L。固體培養(yǎng)基需加2 g/L瓊脂。

分離培養(yǎng)基(YEPD培養(yǎng)基):酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。固體培養(yǎng)基需加2 g/L瓊脂。保藏培養(yǎng)基與活化培養(yǎng)基同分離培養(yǎng)基。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基［14］:酵母浸粉 4 g/L，蛋白胨5 g/L，葡萄糖50 g/L，瓊脂20 g/L。無(wú)機(jī)鹽類:KH2PO40.55 g/L，KCl 0.425 g/L，CaCl20.125 g/L，MgSO40.125 g/L，F(xiàn)eCl30.025 g/L，MnSO40.002 5 g/L，溴酚綠0.022 g/L，pH5.5。

所有培養(yǎng)基均在121℃高壓滅菌15 min后備用，所有試劑均為分析純或生物純。

2 方法

2.1 酵母菌分離

將葡萄破碎，裝入2個(gè)2 L滅菌的發(fā)酵瓶，每瓶裝1 200 mL，25℃自然發(fā)酵，其中一瓶加入40 mg/L SO2作對(duì)照，做2組平行試驗(yàn)。在發(fā)酵前、中、后期分別量取酒樣10 mL，加入到100 mL液體富集培養(yǎng)基中，25℃、170 r/min培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水按不同濃度梯度稀釋，吸取0.2 mL，均勻涂布于分離培養(yǎng)基平板，25℃培養(yǎng)72 h，選擇菌落生長(zhǎng)良好且密度適宜的平板，隨機(jī)挑取10～20個(gè)單菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接，并多次劃線培養(yǎng)以獲得純酵母菌株，編號(hào)，4℃冰箱試管斜面保藏。

2.2 戶太八號(hào)葡萄酒本土酵母篩選

初篩:向大試管中加入杜氏發(fā)酵管，再加入25 mL葡萄汁，滅菌后按體積分?jǐn)?shù)為3%接種量接入活化酵母，并加入40 mg/L SO2，25℃培養(yǎng)。以杜氏管法定時(shí)測(cè)定菌株的發(fā)酵力，篩選出產(chǎn)氣能力較強(qiáng)的菌株，并對(duì)酒液進(jìn)行感官評(píng)定。以空白作對(duì)照。

復(fù)篩:將初篩得到的菌株按體積分?jǐn)?shù)為3%接種量接入25 mL滅菌的新鮮戶太八號(hào)葡萄汁中，25℃培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液的酒精度，進(jìn)一步篩選產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的菌株。

三級(jí)篩選:按體積分?jǐn)?shù)為3%接種量分別向不同無(wú)水乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù)為6%、9%、12%、15%、18%)、SO2濃度(50、100、150、200、250 mg/L)的10 mL葡萄汁中接入活化的復(fù)篩酵母菌液，25℃培養(yǎng)48 h，以杜氏管法測(cè)定酵母的耐受力，全程定時(shí)測(cè)定發(fā)酵速率，篩選出耐酒精且耐SO2能力強(qiáng)的菌株。

2.3 菌種鑒定

表型鑒定［15-16］:菌株劃線接種于WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)72 h，觀察其菌落形態(tài)，并記錄。取活化的菌株種子液，顯微鏡下觀察菌株個(gè)體形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定:采用珠磨法提取酵母基因組DNA［17-18］。以基因組DNA為模板，NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')和NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')為引物，擴(kuò)增 26S rRNA D1/D2區(qū)域［19］。產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由北京華大生物公司測(cè)序。序列在國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，用MEGA4繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合表型特征確定其生物學(xué)地位。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

向1 L葡萄汁中接入體積分?jǐn)?shù)為3%菌株種子液，并加入40 mg/L SO2，分別在不同溫度條件下和不同pH值條件下恒溫發(fā)酵72 h，根據(jù)酒液酒精度大小確定最適發(fā)酵溫度和pH值。

向10 L葡萄汁中接入體積分?jǐn)?shù)為3%的活化菌株種子液，并加入40 mg/L SO2，在最適發(fā)酵條件下發(fā)酵96 h，酒樣經(jīng)5 000 r/min離心后，測(cè)定酒精度、還原糖、干浸出物、總酸、揮發(fā)酸、pH值等指標(biāo)，以此小試發(fā)酵來(lái)驗(yàn)證優(yōu)化的發(fā)酵條件。以EC1118作對(duì)照。

2.5 香氣成分分析

取6 mL酒樣于20 mL樣品瓶中，40℃水浴15 min，插入經(jīng)250℃老化40 min的萃取頭，頂空萃取35 min，將萃取頭插入GC進(jìn)樣口，解析5 min。以EC1118作對(duì)照。

升溫程序:35℃保持4 min，以10℃/min升至110℃，保持6 min;再以5℃/min升至150℃，保持2 min;最后以7℃/min升至230℃，保持4 min。

色譜條件:色譜柱 DB-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250℃。載氣為高純He，流量1.0 mL/min。電離方式E1。電子能量70 eV。離子源溫度230℃.質(zhì)量掃描范圍35～500 amu。用計(jì)算機(jī)檢索標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)NIST08和WILEY7對(duì)照分析并確認(rèn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 酵母菌分離

從戶太八號(hào)葡萄發(fā)酵的前、中、后期醪液中共篩選到135株酵母菌。

3.2 本土酵母篩選

初篩:由表1可知，有1株菌發(fā)酵10 h產(chǎn)氣滿管，5株菌發(fā)酵24 h產(chǎn)氣滿管，7株菌發(fā)酵48 h產(chǎn)氣滿管。搖動(dòng)這13株菌的培養(yǎng)試管，均有淡淡酒香溢出。以這13株產(chǎn)氣能力較強(qiáng)的初篩菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 酵母初篩Table 1 Result of preliminary screening

復(fù)篩:13株初篩菌株所釀酒液中，酒精度不足5%vol的有6株，5% ～6%vol的有3株，6% ～7%vol的有2株，高于7%vol的有2株。選擇所釀酒液酒精度高于5%的7株菌作為產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的菌株，進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

三級(jí)篩選:由表2可知，復(fù)篩得到的7株菌酒精耐受力均在9%vol以上;4株可耐受12%vol酒精度，3株可耐受15%vol酒精度，1株可耐受18%vol酒精度。在葡萄酒釀造中，SO2的添加量一般為60 mg/L［20］。因此，由表3可知，7株菌均滿足生產(chǎn)要求。

表2 耐酒精菌株篩選 單位:株Table 2 Screening of strains for alcohol tolerance

表3 耐SO2菌株篩選 單位:株Table 3 Screening ofstrains for SO2tolerance

綜合三級(jí)篩選和感官評(píng)定結(jié)果，以耐酒精度為18%、編號(hào)S37的菌株為目的菌株，即戶太八號(hào)葡萄酒本土酵母菌株。

3.3 菌種鑒定

酵母菌株S37在WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)如圖1A所示，呈奶油色，略帶淡綠，球形突起，表面光滑，不透明，具有典型釀酒酵母的形態(tài)特征。S37的個(gè)體形態(tài)如圖1(b)所示，為卵圓形，一端出芽生殖。

大量文獻(xiàn)表明，WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中的絕大多數(shù)酵母菌具有很好的鑒別力［21-22］。更有文獻(xiàn)表明，WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對(duì)釀酒酵母的鑒別準(zhǔn)確度可達(dá)100%［23］。為了使鑒定結(jié)果更可靠，對(duì)菌株S37進(jìn)行26S rRNA序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析，如圖2和圖3，菌株S37與釀酒酵母AB733454.1同枝，親緣關(guān)系最近，相似度高達(dá)100%。結(jié)合菌株S37的表型特征可知，菌株S37為釀酒酵母。

圖1 酵母菌株S37的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)Fig.1 Colony and microscopic characteristics of yeast S37

圖2 酵母菌株S37的26S rRNA D1/D2擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Amplified products of 26S rRNA D1/D2 from yeast S37

圖3 酵母菌株S37的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of yeast S37

3.4 發(fā)酵條件優(yōu)化及酒樣品質(zhì)分析

由圖4、圖5可知，菌株S37在24℃發(fā)酵和在pH 5.0條件下產(chǎn)酒精能力最強(qiáng)。經(jīng)小試發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證，24℃、pH 5.0是菌株S37的最適發(fā)酵條件。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，該菌株在發(fā)酵開(kāi)始24 h內(nèi)產(chǎn)氣，發(fā)酵開(kāi)始48 h內(nèi)產(chǎn)氣滿管，產(chǎn)酒精力為 7.5%vol，能耐受18%vol的酒精，SO2耐受性為 150 mg/L。

小試發(fā)酵結(jié)束后，取酒樣進(jìn)行理化指標(biāo)分析，結(jié)果如表4所示，菌株S37產(chǎn)酒能力與對(duì)照商品酵母EC1118僅相差0.4%vol酒精度，且各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合GB 1037—2006的要求。此外，菌株S37所釀酒液酒香濃郁，口感醇厚、協(xié)調(diào)。綜上，菌株S37的最適發(fā)酵條件為24℃、pH 5.0。

圖4 菌株S37發(fā)酵溫度優(yōu)化Fig.4 Optimizing fermentation temperature for yeast S37

圖5 菌株S37發(fā)酵pH優(yōu)化Fig.5 Optimizing fermentation pH for yeast S37

表4 葡萄酒理化指標(biāo)Table 4 Properties of wine

3.5 酒樣香氣成分分析

菌株S37和商業(yè)菌株EC1118所釀酒液香氣成分分析GC-MS總離子圖分別如圖6和圖7所示。利用氣相色譜峰面積歸一化法計(jì)算出各化學(xué)成分的相對(duì)含量，見(jiàn)表5。

圖6 菌株S37所釀酒液香氣成分GC-MS圖Fig.6 The GC-MS total ion chromatogram of aromatic components in wine made by strain S37

圖7 菌株EC1118所釀酒液香氣成分GC-MS圖Fig.7 The GC-MS total ion chromatogram of aromatic components in wine made bycontrast strain EC1118

由表5可知，菌株S37和商業(yè)菌株EC1118所釀的葡萄酒中分別檢出了67種與53種揮發(fā)性化合物，主要香氣物質(zhì)均為高級(jí)醇、酯及酸。相對(duì)于菌株EC1118，菌株S37所釀葡萄酒的主要優(yōu)勢(shì)含量香氣成分(在對(duì)照組未檢出)有18種，其中2-庚醇、2-辛醇、9-癸烯-1-醇、壬醛、異戊酸乙酯、乙酰苯、苯并噻唑、2-乙酰基呋喃等香氣較好，且含量以絕對(duì)優(yōu)勢(shì)勝過(guò)對(duì)照組;正己醇、苯乙醇、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、2-甲基四氫噻吩-3-酮、β-突厥烯酮等香氣優(yōu)雅，含量也高于對(duì)照組。由各種香氣成分及特有比例，形成了菌株S37所釀葡萄酒的獨(dú)特風(fēng)味。

4 結(jié)論

本研究戶太八號(hào)葡萄的自然釀造醪液中分離出135株酵母菌，經(jīng)篩選，最終獲得了適合戶太八號(hào)桃紅葡萄酒釀造的釀酒酵母S37。該菌株是兼性厭氧菌，無(wú)氧條件下亦能發(fā)芽生長(zhǎng);釀酒起酵快，產(chǎn)生的泡沫細(xì)膩，發(fā)酵平穩(wěn)，且不產(chǎn)生H2S;向酒樣中下明膠后澄清速度快且效果好，酒腳壓實(shí)程度良好;發(fā)酵所產(chǎn)酒樣各項(xiàng)理化指標(biāo)均接近商業(yè)菌株EC1118，香氣濃郁、口感醇厚、協(xié)調(diào)，香氣組成與比例適宜，形成了S37所釀葡萄酒的獨(dú)特風(fēng)味，為釀造具有西安地區(qū)特有風(fēng)格特征的葡萄酒創(chuàng)造了酵母資源條件，可作為西安地區(qū)葡萄酒生產(chǎn)特征酵母進(jìn)一步商品化的出發(fā)菌株。

表5 菌株S37與菌株EC1118所釀酒液主要香氣成分對(duì)比表Table 5 Aromacompositions of wine fermented by strain S37 and contrast strain EC1118

續(xù)表5

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