許舉飛，康健，谷方紅，王德良

1(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830046)

2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

麥芽是啤酒的主要原料［1］。它是由大麥制麥而得，制麥工藝包括浸麥、發(fā)芽、凋萎和干燥4個重要階段，麥芽制作成功的標(biāo)志是胚乳細(xì)胞壁被徹底破壞;胚乳內(nèi)的蛋白質(zhì)網(wǎng)被分解;大麥蛋白質(zhì)的溶解性得到增強(qiáng)并形成大量水解酶以使這些變化能持續(xù)進(jìn)行;麥芽獲得在糖化過程中使淀粉迅速分解的潛力。麥芽溶解度即是衡量細(xì)胞壁溶解的好壞的指標(biāo)。好的制麥工藝要求是所制成麥芽的各項(xiàng)理化指標(biāo)適宜，麥芽溶解情況良好，麥芽有適當(dāng)?shù)念伾拖阄?，糖化過程中的浸出物和可發(fā)酵成分含量高，適于釀造優(yōu)質(zhì)啤酒［2］。成品啤酒的質(zhì)量優(yōu)劣與原料麥芽的質(zhì)量好壞有著直接的關(guān)系，麥芽質(zhì)量不良會增加麥汁和啤酒的過濾困難［3］，進(jìn)而會增加啤酒的澀味，同時影響啤酒的非生物穩(wěn)定性［4］。麥芽質(zhì)量對啤酒釀造有著重要作用，而制麥工藝與麥芽質(zhì)量有著密切關(guān)系［5］。

麥芽溶解度是麥芽質(zhì)量的一個重要指標(biāo)［6］，一些釀造過程中出現(xiàn)的問題往往是由于麥芽溶解不良造成的，麥芽溶解度反映了制麥過程中胚乳細(xì)胞壁中β-葡聚糖和蛋白質(zhì)的溶解程度［7］。溶解不良的麥芽，麥芽中營養(yǎng)成分比例失衡，麥汁浸出率低，可發(fā)酵性不佳，成品酒的發(fā)酵度和酒精度低，引起碳水化合物“冷渾濁”，可溶性氮水平低，麥芽汁黏稠，富含β-葡聚糖，會造成麥芽汁流動緩慢，給啤酒過濾帶來困難。麥芽溶解過度也是不可取的。另外麥芽的均一性程度［8］是高質(zhì)量麥芽的重要指標(biāo)。嚴(yán)格控制從大麥到麥芽的工藝管理，降低麥芽質(zhì)量低劣對啤酒生產(chǎn)的影響［9］。麥芽粉質(zhì)疏松易碎且細(xì)膩表示溶解良好，堅(jiān)硬不易咬斷難展開且呈膠狀為溶解不良［10］。麥芽溶解不良或者質(zhì)量不均一，需要外來酶的添加才能彌補(bǔ)麥芽溶解不均一帶來的問題［11］，增加了啤酒生產(chǎn)成本。麥芽含酶量不足，胚乳溶解較差，造成發(fā)酵后期降糖慢且殘?zhí)歉?，生產(chǎn)出的啤酒缺陷明顯［12］。因此提高麥芽溶解度，有利于麥汁中的酶和可溶性成分的數(shù)量和組成，對提高啤酒質(zhì)量是至關(guān)重要的［13］。

目前測定細(xì)胞壁溶解好壞的方法可采用β-葡聚糖分析方法，如Megazyme試劑盒測定麥芽中的β-葡聚糖含量間接來評價胚乳細(xì)胞壁的降解程度，或采用熒光染色法確定細(xì)胞壁溶解程度，即通過可與β-葡聚糖專一性結(jié)合的Calcofluor熒光增白劑，未被溶解的細(xì)胞壁會被著色，呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光，已溶解的部分呈現(xiàn)淺藍(lán)色，對麥?？v切面進(jìn)行染色計(jì)算即可獲得麥芽溶解度［14］，該方法比較真實(shí)地反映了麥芽的溶解情況，且相對簡單直觀。但前者相對繁瑣，且測出的β-葡聚糖包括部分降解的小分子和沒有降解的大分子。為了更加直觀的觀察麥芽的溶解情況，還進(jìn)行了麥芽胚乳縱切面的微觀結(jié)構(gòu)觀察，本文針對影響該指標(biāo)的關(guān)鍵制麥參數(shù)即浸麥度、發(fā)芽溫度、凋萎溫度、干燥溫度，以進(jìn)口大麥為原料，進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上還采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)得到提高麥芽溶解度的最佳制麥工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

進(jìn)口大麥，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

Calcofluor熒光 增 白劑［15］，Sigma 公司;10%KOH。

粘土塊，Daubrew咨詢公司;Carlsberg種子固定系統(tǒng)，Daubrew咨詢公司，包括一個多槽模、壓力機(jī)和大麥磨光機(jī);麥芽溶解度測定儀系統(tǒng)，丹麥Carlsberg公司。JFC-1600型離子束濺射儀，日本電子公司;JSM-6700F型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(JEOL)，日本電子公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥芽溶解度的測定方法

利用Carlsberg種子固定系統(tǒng)可得到2份每份50顆半粒的部分。使用上模和下模將50顆麥粒放在下模之中。借助壓力機(jī)可以使50顆麥粒固定，從而使每顆種子的一半被埋在粘土中。用盤式粉碎機(jī)將這些麥粒磨去一半。用熒光染料(Calcofluor)溶液浸染此半粒谷物2 min，用70% 乙醇沖洗，用濾紙沾除殘留的乙醇。把麥芽半粒組放在麥芽溶解度測定儀上，打開紫外燈。沒有溶解的胚乳呈現(xiàn)藍(lán)色熒光(通?？拷溋５捻敳?，而過度溶解的胚乳呈暗藍(lán)色。溶解后的胚乳的面積占整個胚乳面積的百分比被定義為一顆麥粒的百分溶解度。一個樣品的百分溶解度為100顆麥粒溶解的平均溶解度。

1.2.2 計(jì)算公式

按麥芽溶解程度增加的分組序列，判定每一麥粒屬于哪一組。

0% ＜0＜5%，5% ＜1＜25%，25% ＜2＜50%，50% ＜3 ＜75%，75% ＜4 ＜95%，95% ＜5 ＜100%。

一個麥芽樣品的溶解度計(jì)算方法:M=(0×《0》+0.125×《1》+0.375×《2》+0.625×《3》+0.875×《4》×1《5》)，式中:《0》，《1》，《2》，《3》，《4》，《5》表示每一麥芽溶解度組中的麥粒顆數(shù)。

1.2.3 麥芽胚乳微觀結(jié)構(gòu)觀察

1.2.3.1 麥芽的準(zhǔn)備

用切片刀沿著麥芽的縱切面，上下縱切面相平行，以有麥溝那一大面積的縱切面為觀察面，厚度＜1.0 mm，越薄越好。

1.2.3.2 噴金

把切好的麥芽樣品一個挨著一個依次排列整齊，放在預(yù)先貼有兩面膠的噴金圓盤上，在離子束濺射儀進(jìn)行噴金，大約10 min左右。噴金的目的為了使樣品導(dǎo)電，這樣使樣品能有更好的觀察效果。

1.2.3.3 進(jìn)樣及檢測

按排氣鈕，抽真空，待真空度≤5.14×104Pa，開始進(jìn)樣，一般樣品達(dá)到真空度所需時間一般為30 min，由于本樣品厚度較厚，氣體較多，達(dá)到要求的真空度約需2 h，對于真空泵也有損耗，所以進(jìn)樣之前需對樣品要進(jìn)行脫真空處理。

1.2.3.4 拍照及數(shù)據(jù)輸出

本實(shí)驗(yàn)采用麥芽縱切面×1000進(jìn)行觀察，對每一種麥芽縱切面表面的形貌進(jìn)行觀察，在對樣品進(jìn)行拍照時，選取縱切面的兩個半球的淀粉顆粒多的地方(縱切面中軸線附近)，每個樣品拍照兩次，兩個半球各拍照一次。出樣，先關(guān)掉電子槍，再關(guān)掉加速電壓，關(guān)機(jī)，測試數(shù)據(jù)譜圖采用刻盤形式。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 微型制麥工藝

浸麥:浸三斷二，溫度14～16℃，總浸麥時間20 h左右，浸麥度42～46%左右。

發(fā)芽:發(fā)芽溫度控制在14～16℃，最高綠麥芽水分45～47%。

干燥:50℃，15 h;60℃，1 h;70℃，1 h;80～83℃，5 h。

1.2.4.2 浸麥度對麥芽溶解度的影響

測定浸麥度分別為42%、44%、46%、48%、50%下的麥芽溶解度。

1.2.4.3 發(fā)芽溫度對麥芽溶解度的影響

測定12、14、16、18、20 ℃發(fā)芽溫度下的麥芽溶解度。

1.2.4.4 凋萎溫度對麥芽溶解度的影響

測定不同凋萎溫度44、46、48、50、52 ℃下的麥芽溶解度。

1.2.4.5 干燥溫度對麥芽溶解度的影響

測定74、76、78、80、82 ℃下的麥芽溶解度。

1.2.4.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取浸麥度(A)、發(fā)芽溫度(B)、凋萎溫度(C)、干燥溫度(D)，利用軟件Design Expert 8.0.6進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，以麥芽溶解度為響應(yīng)值，優(yōu)化提高麥芽溶解度條件。試驗(yàn)的因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken分析因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.4.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析和Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，試驗(yàn)結(jié)果為3次試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥芽胚乳微觀結(jié)構(gòu)

麥芽胚乳縱切面微觀結(jié)構(gòu)譜圖按照細(xì)胞溶解度大小依次排列如圖1所示，麥芽溶解度依次為80%、90%、99%。

麥芽細(xì)胞溶解度主要體現(xiàn)在淀粉顆粒、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分解，隨著細(xì)胞溶解度的提高，麥芽淀粉顆粒細(xì)小、均勻，而且間隔(主要是蛋白質(zhì))少，直到分解完全。由圖1可知，當(dāng)麥芽的細(xì)胞溶解度在80%～90% 時，淀粉顆粒分解不完全，大小不均一，大的顆粒中夾雜部分小顆粒，而且間隔(蛋白質(zhì))分解情況不良好，當(dāng)細(xì)胞溶解度＞90% 時，細(xì)胞的淀粉顆粒逐漸趨于均勻化且開始變小，細(xì)胞間隔逐漸變薄，說明蛋白質(zhì)溶解情況變好，當(dāng)細(xì)胞溶解度達(dá)到99% 以上時，蛋白質(zhì)分解趨向完全，且淀粉顆粒均勻度很好。

圖1 麥芽胚乳微觀結(jié)構(gòu)譜圖Fig.1 The microstructure spectrogram of malt endosperm

冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡所需的真空度很高，麥芽樣品處理有一定的難度，厚度達(dá)不到要求，進(jìn)樣前應(yīng)該對樣品進(jìn)行抽真空，對樣品的掃描拍照可以進(jìn)行×200、×500、×1 000、×1 500、×2 000等倍數(shù)的放大，觀察麥芽溶解情況。

2.2 浸麥度對麥芽溶解度的影響

由圖2所示，當(dāng)浸麥度由42%增加至46%時，麥芽溶解度呈現(xiàn)增加的趨勢(P＜0.05)，當(dāng)浸麥度為46%時，麥芽溶解度達(dá)到最大值，此后隨著浸麥度的增大，麥芽溶解度開始緩慢降低，這說明更高的浸麥度，并不一定使麥芽溶解度提高?？赡苁钱?dāng)浸麥度達(dá)到一定量時，大麥不再吸收水分，浸麥時間截止，大麥細(xì)胞結(jié)構(gòu)承受程度達(dá)到最大，此時，我們應(yīng)該終止浸麥，進(jìn)入發(fā)芽階段。而且，浸麥時間過長會造成制麥時間延長和水資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。選取浸麥度46%浸麥較為適宜。

2.3 發(fā)芽溫度對麥芽溶解度的影響

圖2 浸麥度對麥芽溶解度的影響Fig.2 The effect of barley steeping degree on malt solubility

由圖3所示，當(dāng)發(fā)芽溫度從12℃增加至16℃時，隨著發(fā)芽溫度的增大，麥芽溶解度隨之增大，當(dāng)發(fā)芽溫度達(dá)到16℃時，麥芽溶解度達(dá)到最大值，顯著高于其它發(fā)芽溫度下的麥芽溶解度(P＜0.05)，當(dāng)發(fā)芽溫度大于16℃時，麥芽溶解度顯著降低(P＜0.05)。當(dāng)發(fā)芽溫度增加到20℃時，麥芽溶解度大于在發(fā)芽溫度12℃下的麥芽溶解度。周如鏡［16］研究表明，在整個發(fā)芽過程中采用15～20℃的發(fā)芽溫度，基本能滿足麥芽生產(chǎn)對成品麥芽各項(xiàng)指標(biāo)的要求。由于發(fā)芽溫度過高，造成發(fā)芽時間在第3天時，呈現(xiàn)葉芽生長過長的現(xiàn)象，造成麥芽質(zhì)量下降，為了避免此現(xiàn)象，選取發(fā)芽溫度16℃較為適宜。

圖3 發(fā)芽溫度對麥芽溶解度的影響Fig.3 The effect ofbarley germination temperature on malt solubility

2.4 凋萎溫度對麥芽溶解度的影響

由圖4所示，當(dāng)?shù)蛭疁囟葟?4℃增加至46℃時，隨著凋萎溫度的增大，麥芽溶解度增加緩慢，變化幅度不明顯，凋萎溫度達(dá)到48℃時，麥芽溶解度達(dá)到最大值，高于其它凋萎溫度下的麥芽溶解度(P＜0.05)，當(dāng)?shù)蛭疁囟却笥?8℃時，麥芽溶解度開始呈現(xiàn)降低趨勢。選取凋萎溫度48℃較為適宜。

圖4 凋萎溫度對麥芽溶解度的影響Fig.4 The effect of barley searing temperature on malt solubility

2.5 干燥溫度對麥芽溶解度的影響

由圖5所示，當(dāng)干燥溫度從74℃增加至78℃時，隨著干燥溫度的增大，麥芽溶解度隨之增大，當(dāng)干燥溫度達(dá)到78℃時，麥芽溶解度達(dá)到最大值，顯著高于其他干燥溫度下的麥芽溶解度(P＜0.05)，當(dāng)干燥溫度高于78℃時，麥芽溶解度開始呈現(xiàn)緩慢降低趨勢。當(dāng)干燥溫度增加到78℃時，麥芽溶解度大于在干燥溫度74℃下的麥芽溶解度。由于干燥溫度過高，造成麥芽中β-葡聚糖酶失活，78℃是β-葡聚糖酶最佳適宜溫度［17］。管敦儀［18］和 Kunze［19］等的研究表明，β-葡聚糖酶活力的提高可能促進(jìn)了 α-淀粉酶和蛋白酶的形成和釋放，麥芽溶解度增大。若干燥溫度過高造成麥芽中β-葡聚糖、淀粉、蛋白質(zhì)等降解不足，造成麥芽質(zhì)量下降，為了避免此現(xiàn)象，選取干燥溫度78℃較為適宜。這和Karababa［20］等關(guān)于干燥工藝對微型制麥質(zhì)量參數(shù)的影響(凋萎溫度50℃，干燥溫度85℃)的研究有所不同。

圖5 干燥溫度對麥芽溶解度的影響Fig.5 The effect of barley drying temperature on malt solubility

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken design

2.6 試驗(yàn)結(jié)果與模型建立

根據(jù)表1，進(jìn)行浸麥度、發(fā)芽溫度、凋萎溫度、干燥溫度共4因素3水平與麥芽溶解度之間的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，其試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到以麥芽溶解度對編碼自變量A、B、C和D的二次多項(xiàng)回歸方程:麥芽溶解度/%=86.05-0.73A+4.47B-1.02C+1.53D-4.79A2-7.51B2-7.42C2-8.46D2-4.19AB-2.57AC-5.68AD-2.59BC-1.16BD+0.98CD。方差分析及顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3，可知，該回歸方程模型顯著(P=0.008 2＜0.05)，失擬項(xiàng) P=0.109 5＞0.05，失擬性檢驗(yàn)結(jié)果不顯著。這一結(jié)果說明該模型與數(shù)據(jù)擬合程度較高，試驗(yàn)誤差小，可用該模型分析和預(yù)測麥芽溶解度的結(jié)果。對模型回歸方程系數(shù)的顯著性試驗(yàn)表明，一次項(xiàng) B，交互 AD，二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2影響顯著。

表3 麥芽溶解度回歸方程方差分析Table 3 Regression coefficient and analysis of the model

2.7 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，利用Design Expert 8.0.6軟件作不同因素的響應(yīng)面分析圖，并結(jié)合方差分析表，浸麥度、發(fā)芽溫度、凋萎溫度、干燥溫度4個因素及其交互作用對麥芽溶解度的影響結(jié)果可通過圖6～11直接反映出來。由圖6～11可知，4個因素影響大小為 B(發(fā)芽溫度)＞D(干燥溫度)＞C(凋萎溫度)＞A(浸麥度)。

圖6 浸麥度、發(fā)芽溫度及其交互作用的影響Fig.6 The interaction effect of barley steeping degree and germination temperature on malt solubility

圖7 浸麥度、凋萎溫度及其交互作用的影響Fig.7 The interaction effect of barley steeping degree and searing temperature on malt solubility

圖8 浸麥度、干燥溫度及其交互作用的影響Fig.8 The interaction effect of barley steeping degree and drying temperature on malt solubility

2.8 最佳工藝條件的驗(yàn)證

由Design Expert 8.0.6軟件得到麥芽溶解度的最佳制麥工藝條件為浸麥度為45.88%，發(fā)芽溫度為16.36℃，凋萎溫度為48.00℃，干燥溫度為78.04℃，在此條件下，麥芽溶解度為86.96%。為了方便實(shí)際操作，將浸麥度修正為46%，發(fā)芽溫度為16℃，凋萎溫度為48℃，干燥溫度為78℃，在該條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，得到麥芽溶解度為87%，與預(yù)測值86.96% 接近，說明采用響應(yīng)面得到的優(yōu)化工藝結(jié)果可靠，具有一定的實(shí)用價值。與響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)前的麥芽溶解度81%相比，制麥工藝優(yōu)化后，麥芽溶解度提高了7.41%。

圖9 發(fā)芽溫度、凋萎溫度及其交互作用的影響Fig.9 The interaction effect of barley germination temperature and searing temperature on malt solubility

圖10 發(fā)芽溫度、干燥溫度及其交互作用的影響Fig.10 The interaction effect of barley germination temperature and drying temperature on malt solubility

圖11 凋萎溫度、干燥溫度及其交互作用的影響Fig.11 The interaction effect of barley searing temperature and drying temperature on malt solubility

3 結(jié)論

經(jīng)過麥芽胚乳微觀結(jié)構(gòu)觀察，試驗(yàn)表明，當(dāng)麥芽的細(xì)胞溶解度在80～90% 時，淀粉顆粒分解不完全，大小不均一，大的顆粒中夾雜部分小顆粒，而且間隔(蛋白質(zhì))分解情況不良好，當(dāng)細(xì)胞溶解度＞90%時，細(xì)胞的淀粉顆粒逐漸趨于均勻化且開始變小，細(xì)胞間隔逐漸變薄，說明蛋白質(zhì)溶解情況變好，當(dāng)細(xì)胞溶解度達(dá)到99%以上時，蛋白質(zhì)分解趨向完全，且淀粉顆粒均勻度很好。

響應(yīng)面分析結(jié)果表明，麥芽溶解度和各因素之間的關(guān)系為:發(fā)芽溫度主效應(yīng)顯著，各因素對麥芽溶解度影響程度的大小順序?yàn)?B(發(fā)芽溫度)＞D(干燥溫度)＞C(凋萎溫度)＞A(浸麥度)。制麥工藝條件為:浸麥度為46%，發(fā)芽溫度為16℃，凋萎溫度為48℃，干燥溫度為78℃，實(shí)際麥芽溶解度為87%。與優(yōu)化前的麥芽溶解度81%相比，制麥工藝優(yōu)化后，麥芽溶解度提高了7.41%。

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