唐柯，王蓓，馬玥，徐巖，李記明

1(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀酒微生物與酶技術(shù)研究室，江蘇無錫，214122)2(煙臺張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰?，山東煙臺，264000)

有機(jī)酸是葡萄酒中重要的組成成分之一，葡萄酒中的有機(jī)酸主要來源于葡萄果實(shí)(蘋果酸、酒石酸、檸檬酸)以及發(fā)酵過程(乳酸、乙酸、琥珀酸)［1］。有機(jī)酸是葡萄酒中重要的呈味物質(zhì)，是葡萄酒酸度的主要決定因素。有機(jī)酸的種類、含量和比例調(diào)節(jié)著葡萄酒的酸堿平衡，影響著葡萄酒的口感、色澤及生物穩(wěn)定性［2］。

冰葡萄酒是采用特殊釀造工藝釀造的葡萄酒。它是將葡萄推遲采收，在-8℃的氣溫下，果實(shí)掛在枝頭通過自然結(jié)冰和風(fēng)干，葡萄中的糖分得到高度濃縮，在結(jié)冰的狀態(tài)下壓榨、低溫保糖發(fā)酵釀制而成的甜型葡萄酒(VQA，1999)。釀造冰酒的過程十分緩慢，經(jīng)常要花費(fèi)數(shù)個(gè)月才能達(dá)到期望的酒精含量。在如此長時(shí)間發(fā)酵期內(nèi)，保持其發(fā)酵安全性和品質(zhì)的優(yōu)異，口感的協(xié)調(diào)至關(guān)重要，因此冰酒發(fā)酵對酵母和發(fā)酵溫度的選擇具有特殊性。酵母種類對冰酒發(fā)酵過程中乙酸和甘油形成、發(fā)酵速度和冰酒的感官特性有顯著的影響［3］。由于冰葡萄汁的含糖量高，黏度大，高糖引起的高滲透脅迫會產(chǎn)生一定量的乙酸，而使酒的揮發(fā)酸含量高于一般的葡萄酒［4］。因此，冰酒發(fā)酵過程的重點(diǎn)是保持果香，形成優(yōu)雅的酒香和醇和的口感，控制揮發(fā)酸的含量。主要措施就是選擇適宜的酵母菌和控制發(fā)酵溫度。加拿大科學(xué)家在冰酒發(fā)酵過程中選擇了7個(gè)商品酵母進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母ST、N96和EC1118對香氣和乙酸的控制最好，適合釀造冰酒［5］。Pigeau等研究了含糖量高于40°Brix的冰葡萄汁對酵母發(fā)酵的影響，結(jié)果表明隨著冰葡萄汁含糖量的增加，發(fā)酵過程中產(chǎn)生了更多的乙酸和甘油，并且酵母生長速率和乙醇生成量都有所降低［6］。邵威平的研究發(fā)現(xiàn)，冰葡萄酒發(fā)酵溫度為5℃時(shí)，酵母活性受到很大抑制;當(dāng)發(fā)酵溫度高于10℃時(shí)，隨著溫度的升高，發(fā)酵原酒的酒度和揮發(fā)酸明顯增高，總糖、干浸出物和氨基酸含量減少，削弱了冰酒甜潤醇厚的典型性［7］。

我國作為世界上僅有的幾個(gè)能釀造冰葡萄酒的國家，冰酒資源優(yōu)勢非常明顯。但是目前國內(nèi)對冰葡萄酒的研究仍相對較少，而且當(dāng)前的研究更多的集中于冰葡萄酒的釀造工藝及香氣分析［8-10］，對于冰葡萄酒品質(zhì)具有重要影響的有機(jī)酸的系統(tǒng)研究還尚未見報(bào)道。本文以不同釀造條件的冰葡萄酒為研究對象，通過高效液相色譜分析不同酵母不同發(fā)酵溫度對冰葡萄酒有機(jī)酸含量的影響，為進(jìn)一步改進(jìn)冰葡萄酒釀造工藝，提高我國冰葡萄酒品質(zhì)提供科學(xué)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料:選用遼寧省桓仁地區(qū)產(chǎn)2011年份威代爾葡萄，采收時(shí)糖度為32°Brix。

酵母:EC、R2、K1、ST，白香郁均由張?jiān)Ｆ咸丫乒咎峁?/p>

試劑:草酸、酒石酸、甲酸、丙酮酸、L-蘋果酸、莽草酸、L-抗壞血酸、L-乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸等12種有機(jī)酸標(biāo)樣購自Sigma-Aldrich公司，純度均在99%以上。

1.2 儀器與設(shè)備

pH計(jì)，METTLER TOLEDO;恒溫烘箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;循環(huán)水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)，鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司;純水儀，Millipore Simplicity UV Bedford，MA，USA;安捷倫液相色譜儀1200配有紫外檢測器，美國安捷倫公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取草酸等12種有機(jī)酸0.2～0.8 g，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移置10 mL棕色容量瓶中，用流動相定容至刻度，封口，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液，在-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们?，根?jù)實(shí)驗(yàn)需要將此標(biāo)準(zhǔn)貯備液用流動相稀釋至適宜含量，以配制標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 色譜條件

參照段云濤(2007)的方法［14］，略有改動。WATERS Atlantis T3色譜柱(4.6 mm×150 mm ID，3 μm);保護(hù)柱為 PhenomeneX RP-C18Security Guard(4.0 mm×3.0 mm)，紫外檢測波長為210 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10 μL，以峰面積外標(biāo)法定量。

等度洗脫:流動相為:10 mmol/L NaH2PO4，pH 2.7;流速為0.8 mL/min。

冰葡萄酒樣品與流動相按照1∶9(v/v)進(jìn)行稀釋，測定前經(jīng)0.45 μm水相微孔濾膜過濾。

1.5 試驗(yàn)方法

分別在10，15，20 ℃三個(gè)溫度下，接種 EC、R2、K1、ST和白香郁5種釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，酵母接種量統(tǒng)一為1×106個(gè)細(xì)胞/mL，發(fā)酵工藝參照文獻(xiàn)［8］。發(fā)酵設(shè)備采用50 L不銹鋼發(fā)酵罐，每個(gè)處理各發(fā)兩罐。3個(gè)溫度下5種釀酒酵母發(fā)酵的冰葡萄原酒的理化指標(biāo)數(shù)據(jù)見表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行，繪圖采用SigmaPlot 12.1進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性

將酒石酸、琥珀酸、乙酸、丙酮酸、草酸、L-蘋果酸、L-乳酸、檸檬酸、L-抗壞血酸、甲酸、莽草酸和馬來酸共計(jì)12種標(biāo)準(zhǔn)品配成混合樣品，用增高法定性。結(jié)果表明，12種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品在上述色譜條件下，能夠充分分離，并且峰型銳利，分離效果較好(見圖1)。

表1 不同處理?xiàng)l件發(fā)酵的威代爾冰葡萄原酒的理化指標(biāo)Table 1 Characteristics of Vidal ice wine produced by different fermentation conditions

圖1 12種有機(jī)酸標(biāo)樣色譜圖(a)及冰酒樣品色譜圖(b)Fig.1 Chromatogram of twelve organic acids from a standard mixture(a)and an icewine sample(b)by HPLC

2.2 不同釀造方式對冰葡萄酒總有機(jī)酸含量的影響

對不同酵母及不同發(fā)酵溫度發(fā)酵的冰葡萄酒樣品中12種有機(jī)酸含量的測定結(jié)果見表2。從表2中可以看出，在所有冰酒樣品中均檢測到了除甲酸及抗壞血酸外的10種有機(jī)酸。在這10種有機(jī)酸中，蘋果酸的含量最高，約占總有機(jī)酸的50%左右，其次乙酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸的含量也較高。馬來酸的含量最低，平均只有0.002 g/L左右。從總量上來看，20℃ R2酵母發(fā)酵的冰葡萄酒有機(jī)酸含量最高，達(dá)到14.515 g/L，而EC在10℃下發(fā)酵的含量最低，只有12.472 g/L。

酒石酸、蘋果酸與檸檬酸是葡萄果實(shí)中自然形成的3種有機(jī)酸，也是葡萄酒中的3種固有酸;琥珀酸，乳酸，乙酸則是來自于發(fā)酵過程。通常，在葡萄酒中主要的有機(jī)酸類物質(zhì)是酒石酸、蘋果酸與檸檬酸［11］。Kritsunankul等人研究發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量的葡萄酒往往含有較高來自葡萄果實(shí)的有機(jī)酸，而含有較低發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸［12］。從表2中可以，在不同酵母、不同溫度下發(fā)酵的冰酒樣品中酒石酸、蘋果酸與檸檬酸的含量均較高。此外，因?yàn)榘l(fā)酵后的冰酒樣品均未經(jīng)過蘋果酸-乳酸發(fā)酵，所以蘋果酸在冰酒有機(jī)酸的含量很高，占到了總有機(jī)酸的50%左右，而乳酸的含量則非常低。影響葡萄果實(shí)中蘋果酸含量最主要的因素是氣候，較冷環(huán)境收獲的葡萄果實(shí)中蘋果酸含量更高［13］。冰葡萄后熟期環(huán)境溫度較低，因此冰葡萄中蘋果酸含量比普通葡萄果實(shí)更高。段云濤等人的研究中，3款來自加拿大的冰酒中蘋果酸的含量范圍為4.873～5.192 g/L，本實(shí)驗(yàn)蘋果酸含量范圍為6.225～6.855 g/L，略高于其檢測值［14］。

琥珀酸是葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種重要的有機(jī)酸，琥珀酸的味感復(fù)雜，既酸又苦，也是葡萄酒所含有機(jī)酸類中最富于味覺反應(yīng)的一種酸。根據(jù)Castellari等人的研究，耐冷凍沉淀、非耐冷凍沉淀酵母發(fā)酵葡萄酒中琥珀酸含量分別為1.090 g/L、0.530 g/L，可以看出不同酵母發(fā)酵會導(dǎo)致琥珀酸含量有較大差異［15］。Aragon等對不同釀造溫度葡萄酒有機(jī)酸含量變化展開研究，葡萄酒琥珀酸含量范圍為1.03～1.33 g/L，其含量變化與發(fā)酵溫度沒有明顯聯(lián)系［16］。從本研究中結(jié)果看，琥珀酸含量與發(fā)酵溫度也無明顯聯(lián)系。

表2 不同處理?xiàng)l件發(fā)酵的威代爾冰葡萄原酒中有機(jī)酸含量 (n=3) 單位:g/LTable 2 The content of organic acids in Vidal ice wine produced by different fermentation conditions(n=3)

2.2.1 不同酵母對冰酒有機(jī)酸含量的影響

從圖2中可以看出，在10℃的發(fā)酵溫度下，EC、K1和ST產(chǎn)生的有機(jī)酸含量較低，白香郁有機(jī)酸含量最高;在15℃的發(fā)酵溫度下，同樣是ST產(chǎn)生的有機(jī)酸含量最低，EC和K1含量較高，兩者之間并無顯著性差異;在20℃的發(fā)酵溫度下，ST與白香郁的有機(jī)酸含量較低，而R2有機(jī)酸含量最高。綜合來看，ST在3個(gè)溫度下產(chǎn)生的有機(jī)酸含量在5個(gè)酵母中都相對較低。

2.2.2 不同發(fā)酵溫度對冰酒有機(jī)酸含量的影響

圖3是不同發(fā)酵溫度發(fā)酵冰葡萄酒的總有機(jī)酸含量。從圖3中可以看出，5種酵母在3個(gè)不同發(fā)酵溫度下對有機(jī)酸的影響不完全相同。在用EC1118、R2、K1、ST四種酵母釀造的冰酒中，總有機(jī)酸含量隨溫度升高而增加。而白香郁酵母釀造冰酒總有機(jī)酸含量的變化趨勢則與其他4種酵母有所不同，其釀造溫度為10℃時(shí)，總有機(jī)酸含量最高。綜合來看，較低的溫度有利于控制有機(jī)酸含量的生成。

圖2 不同酵母發(fā)酵冰葡萄酒有機(jī)酸含量Fig.2 The content of organic acids fermented with different species of yeast strains

圖3 不同發(fā)酵溫度發(fā)酵冰葡萄酒有機(jī)酸含量Fig.3 The content of organic acids fermented with different temperature

2.3 不同釀造方式對冰葡萄酒乙酸含量的影響

從表2可以看出，在不同溫度不同酵母發(fā)酵的15個(gè)冰酒樣品中，乙酸含量最高的是20℃ R2酵母發(fā)酵的冰酒樣品，達(dá)到2.488 g/L;最低的是10℃下ST酵母發(fā)酵的冰酒樣品，乙酸含量只有1.316 g/L。此外，在不同發(fā)酵溫度下乙酸與總有機(jī)酸含量變化趨勢基本一致，釀造溫度越高，乙酸含量越高，較低的發(fā)酵溫度有利于對乙酸的控制;而不同酵母發(fā)酵的冰酒樣品中，ST對乙酸的控制最好，乙酸生成量最低。

乙酸是葡萄酒釀造過程的“晴雨表”，其含量的高低直接影響到葡萄酒的品質(zhì)。由于冰葡萄汁的高糖濃度作用于酵母細(xì)胞壁后，會形成過高的滲透壓，使酵母代謝異常，一方面使得發(fā)酵過程通常要達(dá)到數(shù)月才可以達(dá)到期望的酒精度，另一方面高糖導(dǎo)致的高滲透壓會形成大量的揮發(fā)酸，其中最主要是乙酸［4］。較低濃度的乙酸對冰酒質(zhì)量不會產(chǎn)生很大影響，乙酸在乙醇乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下和乙醇生成乙酸乙酯，它會給葡萄酒帶來一定的果香味，但是高濃度的乙酸會對葡萄酒的風(fēng)味產(chǎn)生較大影響。在加拿大，VQA(1999)關(guān)于冰酒中揮發(fā)酸的限定是最高不超過2.1 g/L。而Cliff等的研究發(fā)現(xiàn)，冰酒中乙酸的閾值是3.185 g/L，通常絕大多數(shù)冰酒中的乙酸含量都不會超過這個(gè)值［17］。最近一項(xiàng)對于加拿大冰酒的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在加拿大冰酒中乙酸含量范圍很大，在0.49～2.29 g/L之間，但是平均水平在1.3 g/L左右，還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于冰酒中乙酸的感覺閾值，不會對冰酒的風(fēng)味帶來較大影響［18］。表2結(jié)果可以看出，在3個(gè)溫度、5個(gè)酵母發(fā)酵的15款冰酒樣品中，檢測到的乙酸在1.316～2.488 g/L之間，同樣遠(yuǎn)低于3.185 g/L的閾值水平。

2.4 雙因素方差分析

為了進(jìn)一步考察發(fā)酵溫度及酵母與乙酸含量之間的關(guān)系，我們通過雙因素方差分析對其進(jìn)行判斷。表3是各主體間效應(yīng)檢驗(yàn)表及方差分析表，從各項(xiàng)顯著性檢驗(yàn)的P值來看，截距上溫度與酵母對乙酸含量的影響，在0.05的顯著性水平上是非常顯著的，說明無論發(fā)酵溫度還是不同的酵母對冰酒發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸都有很大的影響。

表3 主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)表及方差分析表Table 3 Tests of between-subjects effects

表4是不同溫度對乙酸含量多重比較的結(jié)果，從顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果來看，3個(gè)發(fā)酵溫度兩兩之間都是具有顯著差異的，說明3個(gè)不同的發(fā)酵溫度之間乙酸含量差異很大。

表4 不同溫度對乙酸含量多重比較結(jié)果Table 4 Themultiple comparisons of different temperature

表5是不同酵母對乙酸含量的多重比較結(jié)果，從分局顯著性檢驗(yàn)的結(jié)果來看，在不同酵母發(fā)酵冰酒產(chǎn)生乙醇含量之間，除了酵母EC與R2，EC與K1差異不顯著外，剩余不同酵母之間差異都是極顯著的。

表5 不同酵母對乙酸含量多重比較結(jié)果Table 5 Themultiple comparisons of different yeast strains

3 結(jié)論

本文采用HPLC分析技術(shù)測定了不同溫度不同酵母釀造的威代爾冰葡萄酒中12種主要的有機(jī)酸，結(jié)果表明，在所有冰葡萄酒樣品中均檢測到了除甲酸和抗壞血酸外的10種有機(jī)酸，其中蘋果酸含量最高，酒石酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸的含量也比較高，其他有機(jī)酸含量基本都小于1 g/L，馬來酸含量最低，平均只有0.002 g/L?？傆袡C(jī)酸含量隨釀造溫度升高而增加。較低的發(fā)酵溫度有利于對乙酸的控制。ST酵母在不同發(fā)酵溫度下乙酸含量均較低。

通過雙因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對不同酵母不同溫度下發(fā)酵的15款冰葡萄酒中的乙酸含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，無論發(fā)酵溫度還是酵母種類對冰酒發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸都有極顯著地影響;3個(gè)不同的發(fā)酵溫度之間乙酸含量差異很大;在不同酵母發(fā)酵冰酒產(chǎn)生乙酸含量之間，除了酵母EC與R2，EC與K1差異不顯著外，剩余不同酵母之間差異都是極顯著的。

［1］ Esteves V I，Lima S F，Lima D D，et al.Using capillary electrophoresis for the determination of organic acids in Port wine［J］.Analytica Chimica Acta，2004，513(1):163-167.

［2］ Klampfl C W，Buchberger W，Haddad P R.Determination of organic acids in food samples by capillary zone electrophoresis［J］.Journal of Chromatography A，2000，881(1-2):357-364.

［3］ Cliff M A，Yuksel D，Girard B，et al.Characterization of Ca-nadian ice wines by sensory and compositional analyses［J］.American Journal of Enology and Viticulture，2002，53(1):46-53.

［4］ Kontkanen D，Inglis D，Pickering G，et al.Effect of yeast inoculation rate，acclimatization，and nutrient addition on Icewine fermentation［J］.American Journal of Enology and Viticulture，2004，55(4):363-370.

［5］ Erasmus D J，Impact of yeast strain on the production of acetic acid，glycerol，and the sensory attributes of icewine［J］.American Journal of Enology and Viticulture，2004，55(4):371-378

［6］ Pigeau G M，Bozza E，Kaiser K，et al.Concentration effect of Riesling Icewine juice on yeast performance and wine acidity［J］.Journal of Applied Microbiology，2007，103(5):1 691-1 698.

［7］ 邵威平.冰酒生產(chǎn)工藝及其品質(zhì)影響因素［J］.釀酒，2004(31):73-75.

［8］ 李記明，郭新光.冰葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)解讀與釀造工藝探討［J］.中外葡萄與葡萄酒，2011(5):66-68.

［9］ 王婷，毛亮，時(shí)家樂，等.葡萄酒釀造工藝標(biāo)準(zhǔn)［J］.釀酒科技，2011(7):79-82.

［10］ 王蓓，唐柯，聶堯，等.攪拌棒吸附萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析威代爾冰葡萄酒揮發(fā)性成分［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(11):131-137.

［11］ Mato I，Huidobro J F，Simal-Lozano J，et al.A simple method for the determination of organic acids in grape juice and wine by capillary zone electrophoresis with direct UV detection［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，38:1 175-1 188.

［12］ Kritsunankul O，Pramotea B，Jakmuneeb J.Flow injection on-line dialysis coupled to high performance liquid chromatography for the determination of some organic acids in wine［J］.Talanta，2009，79(4):1 042-1 049.

［13］ Gallander J F.Deacidification of Eastern table wines with Schizosaccharomyces pombe［J］.American Journal of Enology and Viticulture，1977，28(2):65-68.

［14］ 段云濤.葡萄和葡萄酒中9種有機(jī)酸RP-HPLC檢測體系的建立及其相關(guān)研究［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［15］ Castellari L，F(xiàn)erruzzii M，Magrini A，et al.Unbalanced wine fermentation by cryotolerant vs.non-cryotolerant Saccharomyces strains［J］.Vitis，1994，33:49-52.

［16］ Aragon P，Atienza J，Climent M D.Influence of clarification，yeast type，and fermentation temperature on the organic acid and higher alcohols of Malvasia and Muscatel wines［J］.American Journal of Enology and Viticulture，1998，49:211-219.

［17］ Cliff M A，Pickering G J.Determination of odour detection thresholds for acetic acid and ethyl acetate in ice wine［J］.Journal of Wine Research，2006，17(1):45-52.

［18］ Nurgel C，Pickering G J，Inglis D.Sensory and chemical characteristics of Canadian ice wines［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2004，84(13):1 675-1 684.