楊淑鳳， 劉 欣， 鄧國英， 王曉麗， 孫文長

(大連醫(yī)科大學 微生物學教研室，遼寧 大連 116044)

?

結核分枝桿菌中O-甘露糖基化蛋白功能的研究進展

楊淑鳳， 劉 欣， 鄧國英， 王曉麗， 孫文長*

(大連醫(yī)科大學 微生物學教研室，遼寧 大連 116044)

蛋白質的O-甘露糖基化修飾不僅在真菌和哺乳類細胞中廣泛存在，在原核生物中例如分枝桿菌屬、棒狀桿菌屬和鏈霉菌屬中也存在,尤其在引起人類疾病的結核分枝桿菌中研究最多。許多O-甘露糖基化蛋白在結核分枝桿菌毒力以及與宿主相互作用過程中發(fā)揮了重要作用。本文就結核分枝桿菌中O-甘露糖基化蛋白生物學功能的進展加以綜述。

結核分枝桿菌；O-甘露糖基化；Apa蛋白；ConA-lectin

蛋白質O-甘露糖基化修飾在真菌和哺乳類細胞中廣泛存在，近年來發(fā)現(xiàn)在原核生物中也存在著這種翻譯后修飾形式，例如分枝桿菌屬(Mycobacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebaterium)以及鏈霉菌屬(Streptomyces)等，其中以引起人類結核病的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)研究最多。結核分枝桿菌中存在的O-甘露糖基化蛋白多為免疫活性分子，在細菌致病性以及細菌與宿主細胞相互作用中發(fā)揮了重要作用[1]。本文將重點介紹結核分枝桿菌中O-甘露糖基化蛋白生物學作用的進展。

1 概 述

結核分枝桿菌O-甘露糖基化蛋白多為細菌分泌蛋白和細菌表面蛋白[2]。該菌幾乎所有的O-甘露糖基化蛋白都帶有一個分泌用的信號肽[2]，這種定位也預示著在蛋白甘露糖基化過程與蛋白穿梭細菌外膜過程即分泌-轉位(Sec-translocation)存在密切聯(lián)系[3]。從最先確定帶有甘露糖基化修飾的38 ku磷酸結合蛋白(Phosphate-Binding Lipoproteins,Pst-1)和45～47 ku的Apa蛋白(alanine and proline rich secreted protein,Apa)以來，陸續(xù)約有30多種O-糖基化蛋白得以確定[4]。表1列出了目前在結核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)的主要的O-甘露糖基化蛋白及其大致功能。

表1 結核分枝桿菌存在的主要O-甘露糖基化蛋白

2 O-甘露糖基化蛋白參與細菌與宿主細胞的相互作用

2.1 結核分枝桿菌的甘露糖受體(mannose receptor，MR)識別方式

甘露糖定殖基化蛋白在結核分枝桿菌入侵和定殖的過程中發(fā)揮了重要作用。該菌能夠運用多種策略適應和逃避宿主免疫應答，其中借助細菌表面的甘露糖基化生物分子與巨噬細胞表面特定受體的相互作用，并介導進入巨噬細胞的過程就是其中之一[16]。巨噬細胞表面識別甘露糖生物分子的受體主要為C型凝集素受體，例如甘露糖受體、DC-SIGN(DC-specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing nonintegrin，DC-SIGN)以及人類肺表面活性蛋白A(surfactant Protein A，SP-A)等。而通過MR等介導進入巨噬細胞內的受體識別途徑并不引起NADPH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸即還原型輔酶Ⅱ)的激活和吞噬小體的成熟，從而使結核分枝桿菌存活在利于其存活的吞噬囊泡中[16]。細菌的甘露糖基化生物分子除了甘露糖帽脂阿拉伯甘露聚糖(ManLAM) 之外還包括甘露糖基化蛋白[16]。

2.2 O-甘露糖基化蛋白參與受體識別

結核分枝桿菌O-甘露糖基化蛋白可以作為黏附素(adhesin)與巨噬細胞表面特定的C型凝集素受體(lectin receptor， CR)結合[17]。例如最早發(fā)現(xiàn)的結核O-甘露糖基化蛋白Apa與肺SP-A結合并介導細菌定殖到細胞內[6]；19 ku的LpqH (Rv3763)能在體外與人單核吞噬細胞THP-1表面MR結合，提高巨噬細胞對結核菌的嗜菌作用并定殖在細胞內[12]。有些糖蛋白能被巨噬細胞表面的另外一種受體——Toll樣受體(Toll-like Receptors，TLR)2識別。例如PstS-1能通過激活TLR2、TNF-α和FasL來誘導巨噬細胞的凋亡[18]。其他的糖脂蛋白如LpqH和LprG通過與TLR2相互作用能引起宿主細胞發(fā)生一系列的生物學效應。例如抑制MHC-II和MHC-I的抗原加工和遞呈，從而干擾CD4+和CD8+T細胞效應[10，19]。而且值得一提的是LprG在體內激活MHC II類T細胞依賴其甘露糖基化的修飾結構[19]。

2.3 O-甘露糖基化蛋白是重要的抗原

最近的研究表明，結核分枝桿菌的很多脂蛋白是宿主多克隆T細胞的主要靶分子[20]，而O-甘露糖基化蛋白大部分為脂蛋白。因此，結核分枝桿菌O-甘露糖基化蛋白可以作為重要的B細胞抗原和T細胞抗原用于血清診斷甚至疫苗研發(fā)。除了研究較為明確的Apa抗原和Mbp83之外，B細胞抗原PstS-1[8，18]和復發(fā)促進因子Rpf[13]等就是潛在的血清診斷抗原；Apa同時又是重要的T抗原，這里需要指出的是Apa的O-甘露糖基化修飾是T細胞抗原所需的，但在免疫反應性和免疫保護性卻是非必需的[6-7]，這也意味著Apa可以聯(lián)合免疫佐劑作為疫苗的候選。

3 O-甘露糖基化蛋白提高細菌的致病性

3.1 O-甘露糖基化蛋白提高細菌的毒力

結核分枝桿菌的毒力研究多集中在LAM上，除此之外，O-甘露糖基化蛋白也表現(xiàn)出和毒力相關的功能。Marisol O等[10]利用高活性結合肽(high activity binding peptides，HABPs) 的方法從Rv1411c(LprG)、Rv2270(LppN)和Rv3763 (LpqH)等脂蛋白中分離到5個肽段，這些肽段均具有與肺泡上皮細胞和單核巨噬細胞高度特異結合的特性。進一步的體外試驗結果顯示，肺泡上皮細胞和單核巨噬細胞與這些特異性肽段特異結合后，對結核分枝桿菌的吞噬下降。換而言之，在LprG、LppN 和LpqH脂蛋白上存在著與宿主細胞相互作用的核心結構，而且這些核心結構極有可能影響細菌的抗原和毒力[10]。最新的研究表明，LprG是通過其甘露糖修飾來影響結核毒力因子ManLAM在菌體表面的表達[19]。結核磷酸核酮糖激酶Rv3242c也是O-甘露糖基化蛋白，在斑馬魚體內能夠通過抑制氧壓力和自噬途徑來提高細菌在巨噬細胞內的存活[15]。

3.2 Rv1002c是重要的毒力因子

結核分枝桿菌中催化蛋白質發(fā)生O-甘露糖基化修飾的關鍵酶本身也是毒力因子。原核生物中蛋白質O-甘露糖基化的過程遠沒有真核生物中研究的廣泛。真核生物中蛋白質O甘露糖基化過程的關鍵酶是蛋白O-甘露糖基轉移酶(PMT)，通過生物信息學比對的方法發(fā)現(xiàn)，在結核分枝桿菌中存在的唯一PMT是Rv1002c。Chia-Fang等[21]分別將結核分枝桿菌的Rv1002c和非致病性的恥垢分枝桿菌的pmt(Ms5447)敲除后，發(fā)現(xiàn)在非致病結核分枝桿菌中，pmt的敲除并不影響細菌的存活；而在有毒的結核分枝桿菌中Rv1002c的敲除嚴重影響了細菌體外生長甚至菌落的形成；除此之外，敲除株的生長受限性在補充野生株Rv1002c基因后又得到恢復。這些結果說明Rv1002c是結核分枝桿菌重要的生長必需因子。而進一步的動物實驗結果表明，Rv1002c基因突變的結核分枝桿菌喪失對免疫缺陷小鼠的致病性[21]?？梢奜-甘露糖基化修飾對于維持結核分枝桿菌毒力的重要性。

4 結 語

蛋白質的翻譯后修飾對于蛋白功能有著重要的影響，尤其是甘露糖基化修飾。蛋白質O-甘露糖基化修飾在真核生物中尤其哺乳類細胞中分布非常廣泛，也影響著許多蛋白例如鈣粘蛋白等的功能。原核生物中蛋白質O-甘露糖基化修飾存在也說明這種翻譯后修飾非常保守并且非常重要。對于蛋白質O-甘露糖基化的修飾研究更多依賴于技術方法的改進，相信隨著質譜技術和分子生物學技術的突飛猛進，對于細菌中這種重要的翻譯后修飾過程和功能的認識將日益清晰，也必將為結核病的控制和治療提供新的思路。

[1] van Els CA, Corbiere V, Smits K, et al. Toward Understanding the Essence of Post-Translational Modifications for the Mycobacterium tuberculosis Immunoproteome[J]. Front Immunol, 2014,5:361.

[2] Espitia C, Servin-Gonzalez L, Mancilla R. New insights into protein O-mannosylation in actinomycetes[J]. Mol Biosyst, 2010,6(5):775-781.

[3] VanderVen BC, Harder JD, Crick DC, et al. Export-mediated assembly of mycobacterial glycoproteins parallels eukaryotic pathways[J]. Science, 2005,309(5736):941-943.

[4] 楊淑鳳，劉欣，鄧國英，等. 放線菌蛋白O甘露糖基化的研究進展[J]. 生命的化學, 2015,35(2):4.

[5] Horn C, Namane A, Pescher P, et al. Decreased capacity of recombinant 45/47-kDa molecules (Apa) ofMycobacteriumtuberculosisto stimulate T lymphocyte responses related to changes in their mannosylation pattern[J]. J Biol Chem, 1999,274(45):32023-32030.

[6] Ragas A, Roussel L, Puzo G, et al. TheMycobacteriumtuberculosiscell-surface glycoprotein apa as a potential adhesin to colonize target cells via the innate immune system pulmonary C-type lectin surfactant protein A[J]. J Biol Chem, 2007,282(8):5133-5142.

[7] Nandakumar S, Kannanganat S, Dobos KM, et al. O-mannosylation of theMycobacteriumtuberculosisadhesin Apa is crucial for T cell antigenicity during infection but is expendable for protection [J]. PLoS Pathog, 2013,9(10)：e1003705.

[8] Steingart KR, Dendukuri N, Henry M,et al. Performance of purified antigens for serodiagnosis of pulmonary tuberculosis: a meta-analysis [J]. Clin Vaccine Immunol, 2009,16(2):260-276.

[9] Sartain MJ, Belisle JT. N-Terminal clustering of the O-glycosylation sites in theMycobacteriumtuberculosislipoprotein SodC [J]. Glycobiology, 2009,19(1):38-51.

[10]Ocampo M, Curtidor H, Vanegas M, et al. Specific interaction betweenMycobacteriumtuberculosislipoprotein-derived peptides and target cells inhibits mycobacterial entryinvitro[J]. Chem Biol Drug Des, 2014,84(6):626-641.

[11]Smith GT, Sweredoski MJ, Hess S. O-linked glycosylation sites profiling inMycobacteriumtuberculosisculture filtrate proteins [J]. J Proteomics, 2014,97:296-306.

[12]Diaz-Silvestre H, Espinosa-Cueto P, Sanchez-Gonzalez A, et al. The 19kDa antigen ofMycobacteriumtuberculosisis a major adhesin that binds the mannose receptor of THP-1 monocytic cells and promotes phagocytosis of mycobacteria [J]. Microb Pathog, 2005,39(3):97-107.

[13]Romano M, Aryan E, Korf H,et al. Potential ofMycobacteriumtuberculosisresuscitation-promoting factors as antigens in novel tuberculosis sub-unit vaccines[J]. Microbes Infect, 2012,14(1):86-95.

[14]Yang S, Zhang F, Kang J,et al.MycobacteriumtuberculosisRv1096 protein: gene cloning, protein expression, and peptidoglycan deacetylase activity[J]. BMC Microbiol, 2014,14:174.

[15]Mohanty S, Jagannathan L, Ganguli G, et al. A mycobacterial phosphoribosyltransferase promotes bacillary survival by inhibiting oxidative stress and autophagy pathways in macrophages and zebrafish[J]. J Biol Chem, 2015,290(21):13321-13343.

[16]Torrelles JB, Schlesinger LS. Diversity inMycobacteriumtuberculosismannosylated cell wall determinants impacts adaptation to the host[J]. Tuberculosis (Edinb), 2010,90(2):84-93.

[17]Killick KE, Ni Cheallaigh C, O’Farrelly C, et al. Receptor-mediated recognition of mycobacterial pathogens[J]. Cell Microbiol,2013,15(9):1484-1495.

[18]Araujo LS, Mello FC, Silva Nde B,et al. Evaluation of gamma interferon immune response elicited by the newly constructed PstS-1(285-374):CFP10 fusion protein to detectMycobacteriumtuberculosisinfection[J]. Clin Vaccine Immunol, 2014,21(4):552-560.

[19]Gaur RL, Ren K, Blumenthal A, et al. LprG-mediated surface expression of lipoarabinomannan is essential for virulence ofMycobacteriumtuberculosis[J]. PLoS Pathog, 2014,10(9):e1004376.

[20]Seshadri C, Turner MT, Lewinsohn DM, et al. Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response toMycobacteriumtuberculosis[J]. J Immunol, 2013,190(1):278-284.

[21]Liu CF, Tonini L, Malaga W, et al. Bacterial protein-O-mannosylating enzyme is crucial for virulence ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(16):6560-6565.

Advances in O-Mannosylated Proteins in Mycobacterium tuberculosis

YANG Shu-feng, LIU Xin, DENG Guo-ying, WANG Xiao-li, SUN Wen-chang

(Dept.ofMicrobiol.,DalianMed.Uni.,Dalian116044)

O-mannosylation decoration of proteins not only widely exists in fungal and mammalian cells, but also exists in prokaryotes, e.g.Mycobacterium,CorynebateriumandStreptomyces, especially inMycobacteriumtuberculosisthat causes human illness and draw studies the most. Many O-mannosylated proteins play important role during mutual actions inM.tuberculosisvirulence and the host. Advances in biological function of O-mannosylated proteins inM.tuberculosiswere summarized in this paper.

Mycobacteriumtuberculosis；O-mannosylation；Apa；ConA-lectin

楊淑鳳 女，講師，博士。從事結核分枝桿菌細胞壁甘露糖基化蛋白功能研究。Tel：0411-86110303，

E-mail：shufengyang78@163.com

2015-06-12；

2015-07-07

Q936

A

1005-7021(2015)04-0098-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.017

* 通訊作者。男，博士，副教授。從事病原微生物學研究。Tel：0411-86110303，E-mail：2981264350@qq.com