廖穎玲， 耿 寧， 金曉璐， 權(quán)春善,2*， 金黎明,2， 胡文忠,2

(1. 大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600； 2. 生物技術(shù)與資源利用國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

?

以agr基因?yàn)榘悬c(diǎn)快速檢測金黃色葡萄球菌方法的建立

廖穎玲1， 耿 寧1， 金曉璐1， 權(quán)春善1,2*， 金黎明1,2， 胡文忠1,2

(1. 大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600； 2. 生物技術(shù)與資源利用國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

本文旨在建立一種以agr基因?yàn)榘悬c(diǎn)，快速檢測金黃色葡萄球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法。針對金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)控基因agr序列，設(shè)計(jì)了4條特異性引物；優(yōu)化了LAMP體系中甜菜堿、dNTP濃度、長短引物比等因素；通過對14株不同金黃色葡萄球菌菌株和4株其他常見食品致病菌株進(jìn)行檢測，評估引物特異性。結(jié)果表明，在Mg2+濃度為2.4 mmol/L，dNTP濃度為0.8 mmol/L，甜菜堿濃度為0.1 mol/L，長短引物比為1∶8，65 ℃反應(yīng)50 min條件下擴(kuò)增可達(dá)最佳效果。優(yōu)化后的LAMP對14株金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)為陽性，對4株非金黃色葡萄球菌菌株表現(xiàn)為陰性，證明引物具有特異性。本文首次利用agr基因作為靶基因片段，建立了一個簡單、快速、特異性強(qiáng)的檢測金黃色葡萄球菌的方法，在食品安全檢測方面極具意義。

金黃色葡萄球菌；agr；環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增；快速檢測

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)，是目前細(xì)菌性食物中毒和人類化膿性感染中最常見的病原體之一[1]，在自然界中分布極為廣泛。據(jù)美國疾病控制中心報告，近年來由金黃色葡萄球菌引起的感染占細(xì)菌感染的第二位，僅次于大腸埃希菌。金黃色葡萄球菌對人類的危害極大，能夠引起多種人體局部和全身感染，并且是一個非常重要的社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性病原菌[2]。由此可見，金黃色葡萄球菌污染已成為一個世界性的衛(wèi)生問題，威脅著人類的健康和生命，迫切需要建立一種快速檢測金黃色葡萄球菌的方法并及時預(yù)防處理。金黃色葡萄球菌的微生物病原特性非常復(fù)雜并且與大量的毒力因子有關(guān)，而這些毒力因子的表達(dá)受一個由許多基因位點(diǎn)組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控[3]。在這些基因中附屬基因調(diào)節(jié)(accessory gene regulator，agr)系統(tǒng)在毒力基因的表達(dá)與調(diào)控中起決定作用，它也是唯一一個已知的通過群體感應(yīng)機(jī)制調(diào)控的調(diào)節(jié)系統(tǒng)[4-5]。目前金黃色葡萄球菌快速檢測方法包括傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定、免疫檢測[6]、PCR方法[7-9]、基因芯片(gene chip)等。細(xì)菌分離鑒定法操作繁瑣、耗時長；免疫學(xué)方法如乳膠微粒凝集試驗(yàn)、ELISA等，可以縮短檢測時間，但可能受到食物成分及葡萄球菌A蛋白的干擾[10]；而基因芯片方法其生化反應(yīng)條件和過程不可控，反應(yīng)效率較低，檢測結(jié)果重復(fù)性較差。本文選用Notomi 等[11]報道的依賴于能夠識別靶序列上 6 個特異區(qū)域的 4 條引物和一種具有鏈置換特性的DNA 聚合酶的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 技術(shù)，在等溫條件下高效、快速、高特異地?cái)U(kuò)增agr靶序列，達(dá)到快速檢測食物中金黃色葡萄球菌的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、大腸埃希菌(CMCC 44102)、副溶血弧菌(CGMCC 1.1616)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC 50115)、單增李斯特菌(GIM 1.229)均購自中國微生物菌種網(wǎng)；14株金黃色葡萄球菌由大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院崔京春教授惠贈。

1.1.2 試劑 蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸粉、NaCl購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)購自北京夏新生物技術(shù)有限公司；Bst DNA聚合酶、DL5000 Marker、MgCl2、甜菜堿、dNTP Mixture、6×Loading Buffer 購自大連寶生物公司；引物委托上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3 儀器與設(shè)備 ABI 9700型PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)，DYCP-31DN型電泳儀(北京六一儀器廠)，GelDoc-It型凝膠成像儀(美國UVP公司)，SW-OJ-2FD型潔凈工作臺(蘇州安泰安氣技術(shù)有限公司)，H1850R型離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，Eppendorf移液槍(德國Eppendorf公司)，海爾微波爐(青島海爾微波制品有限公司)，MT-180B生化恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 提取模板DNA 分別挑取金黃色葡萄球菌和其他待檢菌株于LB固體培養(yǎng)基平板上劃線接種，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。按史偉峰等[12]提取DNA的方法稍作修改。挑取培養(yǎng)好的單菌落置于裝有50 μL無菌水的PCR小管中，95 ℃反應(yīng)5 min后取出，13 000 r/min 離心2 min 待用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中agr基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 3.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，得到一套特異性的LAMP引物，包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP，引物序列見表1。

表1 LAMP 引物

1.2.3 PCR反應(yīng)條件 利用B3、F3、BIP、FIP引物擴(kuò)增靶基因，反應(yīng)體系為 25.0 μL，包含外引物(F3和B3)各 1.6 μmol/L，內(nèi)引物(FIP和BIP)各0.2 μmol/L，dNTP 0.5 mmol/L，Bst DNA polymerase 1.0 μL(8 U)，甜菜堿 0.032 mmol/L，模板 2.0 μL，MgCl22 mmol/L，ddH2O補(bǔ)足體積至 25.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)5 min，冷卻，取出加入 Bst DNA聚合酶，繼續(xù)反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為 65 ℃ 擴(kuò)增50 min， 80 ℃ 10 min使酶滅活。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測 將獲得的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，取 10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL 6×Loading Buffer 混勻后，加樣到 1.5%瓊脂糖凝膠中，110 V電泳 30 min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，記錄結(jié)果。

1.2.5 特異性分析 利用外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP，按照上述LAMP方法，對大腸埃希菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、14 株金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化 為增加LAMP方法檢測的準(zhǔn)確性，利用單一變量的方法分別對反應(yīng)溫度(67～61 ℃)，反應(yīng)時間(20～60 min)，MgCl2濃度(0.8～4.0 mmol/L)，dNTP濃度(0.3～1.0 mmol/L)，甜菜堿濃度(0.1～0.4 mol/L)和內(nèi)、外引物濃度比等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

為提高LAMP方法的檢測效果，分別對其反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、MgCl2濃度、dNTP濃度、甜菜堿濃度和引物比例等擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.1.1 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化 設(shè)置反應(yīng)溫度分別為67、65、63、61 ℃，擴(kuò)增50 min，使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果見圖1。由圖1可知，當(dāng)反應(yīng)溫度為65 ℃時擴(kuò)增條帶最清晰。故確定65 ℃為LAMP最適反應(yīng)溫度。

2.1.2 LAMP反應(yīng)時間的優(yōu)化 設(shè)置反應(yīng)時間分別為 20、30、40、50、60 min，擴(kuò)增50 min，使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2。由圖2可知，反應(yīng)40 min后開始出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，但條帶不清楚，反應(yīng)50 min后擴(kuò)增條帶逐漸變亮、變清晰。故確定50 min作為LAMP最適反應(yīng)時間。

圖1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig.1 The optimization of the reaction temperatureM：DNA marker 5 000 bp ；1～4：反應(yīng)溫度分別為67、65、63、61 ℃；5為陰性對照M：DNA marker 5 000 bp; 1：67 ℃; 2：65 ℃; 3：63 ℃; 4：61 ℃; 5：negative control

圖2 反應(yīng)時間的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the reaction timeM：DNA marker 5 000 bp；1～5：反應(yīng)時間分別為 20、30、40、50、60 minM：DNA marker 5 000 bp; 1：20 min; 2：30 min; 3：40 min; 4：50 min; 5：60 min

2.1.3 LAMP反應(yīng)體系中MgCl2濃度的優(yōu)化結(jié)果 調(diào)整反應(yīng)體系中MgCl2濃度分別為0.8、1.6、2.0、2.4、3.2、4.0 mmol/L，擴(kuò)增50 min，使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖3。由圖3可知，擴(kuò)增條帶的亮度隨MgCl2濃度增加而變亮，當(dāng)MgCl2濃度達(dá)到2.4 mmol/L時最清晰，但不再隨MgCl2濃度增加而改變。故確定LAMP反應(yīng)體系中MgCl2最適濃度為2.4 mmol/L。

2.1.4 LAMP反應(yīng)體系中dNTP濃度的優(yōu)化 設(shè)dNTP濃度分別為0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L，擴(kuò)增50 min，使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖4。由圖4可知，擴(kuò)增條帶的亮度隨dNTP濃度增加而逐漸增大，當(dāng)dNTP濃度達(dá)到0.8 mmol/L時最清晰。故確定LAMP反應(yīng)體系中dNTP最適濃度為0.8 mmol/L。

圖3 MgCl2濃度的優(yōu)化Fig.3 The optimal concentration of MgCl2M：DNA marker 5 000 bp；1～6：MgCl2濃度分別為0.8、1.6、2.0、2.4、3.2、4.0 mmol/LM：DNA marker 5 000 bp; 1：0.8 mmol/L; 2：1.6 mmol/L; 3：2.0 mmol/L; 4：2.4 mmol/L; 5：3.2 mmol/L; 6：4.0 mmol/L

圖4 dNTP 濃度的優(yōu)化Fig.4 The optimal concentration of dNTPM：DNA marker 5 000 bp；1～4：dNTP濃度分別為0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L M：marker 5 000 bp; 1：0.3 mmol/L; 2：0.5 mmol/L; 3：0.8 mmol/L; 4：1.0 mmol/L

2.1.5 LAMP反應(yīng)體系中甜菜堿濃度的優(yōu)化 將甜菜堿濃度分別調(diào)整到0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L，擴(kuò)增50 min，使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果見圖5。由圖5可知，擴(kuò)增條帶的亮度隨甜菜堿濃度增加而減弱，甜菜堿濃度在 0.1 mol/L時條帶最清晰。故確定LAMP反應(yīng)體系中甜菜堿最適濃度為0.1 mol/L。

2.1.6 LAMP反應(yīng)體系中外引物和內(nèi)引物濃度比的優(yōu)化 調(diào)整外、內(nèi)引物濃度比分別為1∶4(即外引物各0.4 μmol/L，內(nèi)引物各1.6 μmol/L)和1∶8(即外引物各0.2 μmol/L，內(nèi)引物各1.6 μmol/L)，擴(kuò)增50 min，使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果見圖6。由圖6可知，擴(kuò)增條帶在引物濃度比為1∶8時條帶最清晰，故確定LAMP反應(yīng)體系中外、內(nèi)引物最適濃度比為1∶8。

圖5 甜菜堿濃度的優(yōu)化Fig.5 The optimal concentration of BetaineM：DNA marker 5 000 bp ；1～4：甜菜堿濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mol/LM：DNA marker 5 000 bp; 1：0.1 mol/L; 2：0.2 mol/L; 3：0.3 mol/L; 4：0.4 mol/L

圖6 引物濃度比的優(yōu)化Fig.6 The optimal concentration of primersM：DNA marker 5 000 bp； 1：引物濃度比為1∶4；2：引物濃度比為1∶8 M：DNA marker 5 000 bp; 1：the concentration ratio between inner primer and outer primer is 1∶4; 2：the concentration ratio between inner primer and outer primer is 1∶8

2.2 引物的特異性

圖7 金黃色葡萄球菌的特異性檢測結(jié)果Fig.7 The result of primers specificity

M：DNA marker 2 000 bp ；1～14：不同的金黃色葡萄球菌；

15：陰性對照；16：陽性對照；17～20：副溶血弧菌、大腸埃希菌、單增李斯特菌、沙門氏菌

M：DNA marker 2 000 bp; 1～14：differentS.aureusstrain; 15：negative control; 16：positive control; 17：Vibrioparahaemolyticus; 18：Escherichiacoli; 19：Listeriamonocytogenes; 20：Salmonellarange

用優(yōu)化后的LAMP體系分別對18株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，特異性檢測結(jié)果如圖7所示，14株金黃色葡萄球菌均得到陽性結(jié)果，其他4株非金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為陰性。

3 討 論

隨著科技的發(fā)展及生活水平的提高，人們越來越關(guān)心自身的健康問題，對于食品安全的關(guān)注也更為迫切。目前，用于金黃色葡萄球菌檢測的靶基因主要從特異性基因位點(diǎn)、抗藥性基因和毒素基因三個方面入手[13]。包括耐藥性相關(guān)基因mecA和femA，毒素相關(guān)基因SEA、SEB、SEC、SED、SEI和SEJ等，特異性鑒別基因nuc、clfA、scpA、sspB和SmaI酶切片段等[14]。本研究通過對不同食品中金黃色葡萄球菌特有的分子特征和生理生化特性進(jìn)行比較分析，選擇了agr作為檢測金黃色葡萄球菌的特異靶基因。在病原菌中存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)致病因子分泌的機(jī)制，agr和sarA是金黃色葡萄球菌中研究最多的毒力響應(yīng)調(diào)節(jié)因子，其中起中心作用的是agr群體感應(yīng)系統(tǒng)，近年來成為細(xì)菌毒素分泌調(diào)節(jié)研究及新型抗菌藥物研發(fā)的熱點(diǎn)[15]。由于agr具有較好的特異性，因此利用agr作為一個新的藥物靶點(diǎn)來進(jìn)行研究，具有良好的應(yīng)用前景。

設(shè)計(jì)引物時，將agr的基因序列在GenBank上同源對比，對獲得的同源序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)片段的DNA序列與數(shù)據(jù)庫的SA具有100%同源性，而與其他葡萄球菌和非葡萄球菌沒有同源性或同源性很低。同時，對設(shè)計(jì)出來的4種引物進(jìn)行特異性檢測，發(fā)現(xiàn)其具有良好的特異性，并且能明確地?cái)U(kuò)增靶基因，達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。最后，評估LAMP檢測方法的特異性并對其反應(yīng)條件進(jìn)行細(xì)致的優(yōu)化，包括反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、MgCl2濃度、dNTP濃度、甜菜堿濃度和長短引物濃度比等擴(kuò)增條件。

本研究建立了一種新的LAMP檢測方法，該方法將對金黃色葡萄球菌的臨床診斷和食品安全監(jiān)測發(fā)揮重要作用。

[1] Tirado C, Schimdt K. WHO surveillance programme for control of food-borne infections and intoxications: preliminary results and trends across greater Europe [J]. Infect, 2001, 43: 80-84.

[2] Turabelidze G, Lin M, Wolkoff B, et al. Personal hygiene and methicillin-resistantStaphylococcusaureusinfection[J]. Emerg Infect Dis, 2006, 12: 422-427.

[3] Pragman AA, Schlievert PM. Virulence regulation inStaphylococcusaureus: the need for in vivo analysis of virulence factor regulation [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2006, 42(2):147-154.

[4] 王軍華, 權(quán)春善, 鄭維, 等. 金黃色葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)[J]. 中國生物工程雜志, 2008, 28(6): 93-99.

[5] 權(quán)春善, 范圣第. 新型藥物靶點(diǎn) agr 群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)雜志, 2008, 28(4): 74-77.

[6] Yazdankhah SP, Solverod L, Simonsen S, et al. Developmentand evaluation of an immunomagnetic separation-ELISA for the detection ofStaphylococcusaureusthermostable nuclease incomposite milk[J]. Vet Microbiol, 1999, 67(2): 113-125.

[7] Wilson IG, Cooper JE, Gilmour A. Detection of enterotoxigenicStaphylococcusaureusin dried skimmed milk: use of the polymerase chain reaction for amplification and detection of staphylococcal enterotoxin genesentB andentC1 and the thermonuclease gene nuc[J]. Appl Environ Microbiol, 1991, 57(6): 1793-1798.

[8] Straub JA, Hertel C, Hammes WP. A 23S rDNA-targeted polymerase chain reaction-based system for detection ofStaphylococcusaureusin meat starter cultures and dairy products[J]. J Food Prot, 1999, 62(10): 1150-1156.

[9] 田靜, 計(jì)融, 楊軍, 等. PCR 方法快速檢測食品中的金黃色葡萄球菌[J]. 衛(wèi)生研究, 2007, 2:183-186.

[10]唐夢君, 周生, 葛慶聯(lián), 等. 應(yīng)用LAMP快速檢測金黃色葡萄球菌的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，2011, 27(6): 719-722.

[11]Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al．Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28(12):63.

[12]史偉峰, 史梅, 羅光華, 等. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測金黃色葡萄球菌[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志，2011, 29(5): 339-341.

[13]范一靈, 潘峰, 史賢明. 金黃色葡萄球菌分子檢測技術(shù)的常用靶基因[J]. 微生物學(xué)雜志，2008, 28(3): 72-76.

[14]姜延龍, 張宇, 田波, 等. PCR 技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(5): 265-269.

[15]ChanWC, Coyle B, Williams P. Regulation of virulence determinants inStraphylococcusaureus: complexity and applications [J]. FEMS Microbiol Rev，2004, 28(2):183-200.

The Establishment of a Rapid agr Gene-Targeting Detection Method for Staphylococcus aureus

LIAO Ying-ling1， GENG Ning1， JIN Xiao-lu1， QUAN Chun-shan1,2， JIN Li-ming1,2， HU Wen-zhong1,2

(1.Coll.ofLifeSci.,DalianNationalitiesUni.,Dalian116600; 2.KeyLab.ofBiotech. &Bio-Res.Util.,TheStateEthnicAffairsComm. &Minist.ofEdu.,Dalian116600)

This paper aims to establish a method of a loop-mediated isothermal amplification assay (LAMP) for the rapid detection ofStaphylococcusaureus. Firstly, a highly specific set of four primers was designed according to the accessory gene regulator ofS.aureus. Secondly, the concentration of betaine, dNTP and the ratio of long and short primer ratio, and other factors in the LAMP system were optimized. Finally, the specificity of primers was tested and evaluated against 14S.aureusstrains and 4 other pathogenic strains. The results showed that the effect of the amplification reached to an optimal effects under 65 ℃ react for 50 min, concentration of Mg2+at 2.4 mmol/L, concentration of dNTP at 0.8 mmol/L, and betaine at 0.1 mol/L, and the ratio of long and short primer at 1∶8. After the optimization the LAMP assay forS.aureuswas positive, while negative for non-S.aureusstrains, thus proved that the primers had the specificity. A simple, rapid and strong specific assay for detectingS.aureushas been established usingagrgene as the target gene for the first time. It possessed significance in food security detection.

Staphylococcusaureus;agr; loop-mediated isothermal amplification; rapid detection

科技部十二五國家科技支撐計(jì)劃(2012BAD38B05)；中央高校基本科研基金(DC12010118)

廖穎玲 女，本科。研究方向?yàn)樯锕こ?。Tel:0411-87656219, E-mail:yingling2014@139.com

* 通訊作者。女，教授，博士。研究方向?yàn)樯锕こ?、微生物學(xué)。Tel:0411-87656219,E-mail:mikyeken@dlnu.edu.cn

2014-10-12；

2014-11-18

Q789; R378.2+1

A

1005-7021(2015)04-0019-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.004