王曉紅， 范學(xué)財(cái)，2， 張吉生， 王 勇， 郭宇航， 曼 薩， 張曉麗*

(1.佳木斯大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154003)

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鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥情況及碳青霉烯酶基因檢測(cè)

王曉紅1， 范學(xué)財(cái)1，2， 張吉生1， 王 勇1， 郭宇航1， 曼 薩1， 張曉麗1*

(1.佳木斯大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154003)

了解佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性及碳青霉烯酶包括苯唑西林酶和金屬酶相關(guān)耐藥基因分布情況，為臨床抗菌藥物的合理選擇提供依據(jù)。2013年9月至2014年12月使用VITEK-II全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏測(cè)試系統(tǒng)篩選出佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床標(biāo)本鮑曼不動(dòng)桿菌69株；采用多重PCR方法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶的碳青霉烯酶相關(guān)耐藥基因16S rRNA、OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP、VIM、SIM，并對(duì)耐藥基因擴(kuò)增的陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行DNA 序列分析。69株AB對(duì)亞胺培南、美洛培南的耐藥率分別為36.2%、37.68%，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均高于50%。6種耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果為69株(100%) 攜帶OXA-51基因，32株(46.4%) 攜帶OXA-23基因，17株(24.6%) 攜帶OXA-24基因，5株(7.2%)攜帶OXA-58基因，1株(1.4%)攜帶IMP基因。25株碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，22株(88%) 攜帶OXA-23，1株(4%) 攜帶OXA-58，10株(40%) 攜帶OXA-24，6株(24%)同時(shí)攜帶OXA-23、OXA-24。 DNA 序列分析結(jié)果顯示：OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58分別與NCBI 的序列同源性均為99%。產(chǎn)OXA-23 型碳青霉烯酶可能是佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯酶類抗菌藥物耐藥的主要原因，另外佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院存在OXA-24型耐藥基因鮑曼不動(dòng)桿菌的區(qū)域性流行。

鮑曼不動(dòng)桿菌；碳青霉烯酶；耐藥性；耐藥基因；苯唑西林酶(OXA)

目前多重耐藥和泛耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率逐年升高，其感染率、耐藥率及臨床致死率也日趨嚴(yán)重，引起廣泛關(guān)注[1]。碳青霉烯類抗菌藥物是迄今抗菌譜最廣、抗菌活性最強(qiáng)的一類高效、廣譜的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物[2]。伴隨碳青霉烯類抗菌藥物的臨床應(yīng)用，使耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動(dòng)桿菌(Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii, CRAB)不斷出現(xiàn)并廣泛傳播[3-4]。碳青霉烯酶能夠水解碳青霉烯類抗菌藥物成為碳青霉烯類抗菌藥物的主要耐藥機(jī)制之一[5]。為了解鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶相關(guān)耐藥基因存在情況，本研究對(duì)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年至2014年臨床分離的69株鮑曼不動(dòng)桿菌的苯唑西林酶和金屬酶基因進(jìn)行檢測(cè)并分析。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來(lái)源 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年9月至2014年12月臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌共69株，除去重樣本，全部菌株用Vitek II Compact(法國(guó)生物梅里埃公司)進(jìn)行菌種鑒定及體外藥物敏感性分析。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[6]合成引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

1.2.2 DNA模板制備 用煮沸法制備DNA模板。細(xì)菌菌落懸浮于8.5 g/L NaCl中至5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝? 13 000 r/min離心2 min，重懸于200 μL的無(wú)菌雙蒸水， K10CD干式恒溫器煮10 min，13 000 r/min離心10 min，上清液DNA保存20 ℃。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序 多重PCR檢測(cè)OXA酶基因(blaOXA-23-like、 blaOXA-24-like、blaOXA-51-like、blaOXA-58-like)反應(yīng)體系：Platinum Multiplex PCR Master Mix 12.5 μL，Primer(10 μmol/L) 0.2 μL，Template DNA 1 μL，GC Enhancer 2 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃ 2 min；(95 ℃ 30 s，60 ℃ 90 s，72 ℃ 60 s)35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。16S rRNA、IMP、SIM、VIM反應(yīng)體系：5×buffer 5 μL, 10 μmol/L dNTP 0.5 μL, 5 U/μLTaq0.2 μL, 10 μmol/L Primer mix 1 μL, 2 ng/μL DNA模板 1 μL。反應(yīng)條件: 94 ℃，5 min；(94 ℃ 30 s， 58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s)35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 10 min，4 ℃保存。5 μL PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。PCR產(chǎn)物由哈爾濱博仕生物有限公司進(jìn)行純化并雙向測(cè)序，序列與GenBank blast比對(duì)進(jìn)行同源性分析。

表1 擴(kuò)增各種OXA 及MBL碳青霉烯酶基因的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)本來(lái)源及臨床分布

經(jīng)16S rRNA陽(yáng)性鑒定,69株均為鮑曼不動(dòng)桿菌，標(biāo)本主要來(lái)源于痰標(biāo)本79.7%，其余來(lái)自腦脊液、分泌物、血液和傷口膿液分別為10.1%、4.3%、4.3%和1.4%。來(lái)源科室ICU 檢出率最高，其次為呼吸科和急診科， 分別為17.4%、14.5%和14.5%。

2.2 鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性

鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥表型結(jié)果：69株菌中亞胺培南、美洛培南的耐藥株數(shù)(耐藥率)分別為25株(36.2%)、26株(37.7%)，其余抗生素耐藥率均高于50%。

2.3 碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果

69株(100%) 攜帶OXA-51基因，32株(45.5%) 攜帶OXA-23基因，17株(24.6%) 攜帶OXA-24基因，5株(7.2%)攜帶OXA-58基因，1株(1.4%)攜帶IMP基因。其中同時(shí)含有OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58四種基因的標(biāo)本2株，OXA-51、OXA-23、OXA-24三種基因陽(yáng)性標(biāo)本12株，OXA-51、OXA-58同時(shí)陽(yáng)性樣本3株，OXA-51、OXA-24同時(shí)陽(yáng)性樣本3株，OXA-51、OXA-23同時(shí)陽(yáng)性樣本18株(圖1)。含有DNA 序列分析結(jié)果顯示:OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58分別與NCBI 的序列同源性均為99%。經(jīng)測(cè)序與GenBank公布的核酸序列99%同源。

圖1 多重PCR檢測(cè)OXA基因電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of OXA gene DNA by Multiplex PCR method

12～44：樣本序號(hào)；39：陰性對(duì)照；M：DNA marker

12～44：indicate samples number; 39：indicates negative control; M：indicates DNA marker

25株碳青霉烯類藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中，22株(88%) 攜帶OXA-23，1株(4%) 攜帶OXA-58，10株(40%) 攜帶OXA-24，6株(24%)同時(shí)攜帶OXA-23、OXA-24。另外將OXA-24基因與NCBI Blast 比對(duì)后發(fā)現(xiàn)為OXA-72亞基因型(圖2)。

圖2 OXA-24序列 NCBI Blast 比對(duì)結(jié)果Fig.2 Sequence alignment of OXA-24 by NCBI Blast

3 討 論

1991年，美國(guó)報(bào)道了首例對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，隨之世界各地相繼出現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥且逐年增高， 研究發(fā)現(xiàn)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性與產(chǎn)碳青霉烯酶關(guān)系密切。碳青霉烯酶主要是Ambler 分子結(jié)構(gòu)分類法中的B類和D類β-內(nèi)酰胺酶， B類酶就是金屬酶(metallo-beta-lactamases，MBLs) ，能高效水解β-內(nèi)酰胺類藥物，發(fā)揮活性需要金屬離子Zn2+，獲得性金屬酶可分為5型IMP、VIM、SIM、SPM和GIM[7-8]， 國(guó)內(nèi)金屬酶分離率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于blaOXA基因的分離率，本研究對(duì)前三型進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出1株IMP基因陽(yáng)性株，IMP陽(yáng)性株對(duì)亞胺培南體外敏感，說(shuō)明其介導(dǎo)耐藥可能與I類整合子相關(guān)。

D類酶又稱苯唑西林酶(Oxacillin-hydrolyzing, OXA)，因其可水解苯唑西林而命名，其催化機(jī)制是在絲氨酸催化底物和酶形成一個(gè)共價(jià)酰基中間產(chǎn)物，并隨后脫?；功?內(nèi)酰胺環(huán)上C-N連接水解，導(dǎo)致藥物失活[9]，發(fā)現(xiàn)主要包括6個(gè)亞組，分別為OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、OXA-143和最近發(fā)現(xiàn)的OXA-235[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶OXA-51和OXA-23基因的菌株對(duì)碳青霉烯類抗生素抗菌藥物的耐藥率達(dá)到87.5%，呈現(xiàn)多重耐藥和廣泛耐藥，提示攜帶OXA-23基因可能是導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制之一，這與其他國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[11]。另外本研究中發(fā)現(xiàn)14株鮑曼不動(dòng)桿菌含有OXA-24基因，我國(guó)大部分地區(qū)以O(shè)XA-51、OXA-23為組，OXA-24檢出極少[12]，OXA-24曾在歐洲包括美國(guó)、西班牙、德國(guó)、韓國(guó)、克羅地亞等地暴發(fā)[13-15]，2004年我國(guó)臺(tái)灣首次報(bào)道OXA-24產(chǎn)酶株之后，我國(guó)大陸地區(qū)2006年也發(fā)現(xiàn)同亞型株[11]。OXA-24亞組包括OXA-40(與OXA-24相似)、OXA-25、OXA-26和OXA-72，本研究檢測(cè)出的OXA-24基因測(cè)序后Blast比對(duì)與OXA-72 同源性為99%，是否說(shuō)明我國(guó)黑龍江東部地區(qū)有局部范圍OXA-72鮑曼不動(dòng)桿菌流行有待進(jìn)一步研究，其樣本來(lái)源包括ICU、急診、神經(jīng)外科、神經(jīng)內(nèi)科、呼吸科、血液科、放化療等科室，科室分散，但CRAB中攜帶OXA-24的菌株中有40%，其與碳青霉烯酶等抗生素多重耐藥可能相關(guān)。OXA-58組主要是OXA-58和OXA-97，是一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的D類酶，與OXA-51的同源性約59%，能水解青霉素、苯唑西林和亞胺培南，但不能水解頭孢菌素類[16]。本研究結(jié)果中OXA-58基因檢出率較低，且僅有1株攜帶OXA-58基因?yàn)閬啺放嗄夏退帯?/p>

本研究中鮑曼不動(dòng)桿菌檢測(cè)結(jié)果以攜帶OXA-23基因?yàn)橹髑夷退幮暂^強(qiáng)，另外發(fā)現(xiàn)有部分菌株攜帶OXA-24基因，為本地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌的流行病學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)。當(dāng)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥時(shí)，臨床醫(yī)師可選擇藥物會(huì)更少。因此，在臨床上應(yīng)重視預(yù)防對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的傳播且合理選用抗菌藥物治療。

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Carbapenemase Gene Detection of Acinetobacter baumannii in the Hospital

WANG Xiao-hong1, FAN Xue-cai1，2, ZHANG Ji-sheng1,WANG Yong1, GUO Yu-hang1, SEDZRO Divine Mensal1, ZHANG Xiao-li1

(1.Dept.ofLab, 1st.Affil.Hosp.,JiamusiUni,Jiamusi154007; 2.Dept.ofLab, 2ndAffil.Hosp.,JiamusiUni.,Jiamusi154003)

In order to understand the distribution ofAcinetobacterbaumanniidrug-resistance and carbapenemase including oxacillinase (OXA) and metalloenzyme (MLE) related resistance genes in the affiliated hospitals of Jiamusi University to provide a foundation for reasonable choice of clinical antibiotic medicine. 69A.baumanniistrains were collected and screened in the hospital clinical samples identified by VITEK-II full-automatic microbial identification/susceptibility testing machine from September 2013 to December 2014. Multiplex PCR detection method was used to detect carbapenemase related resistant genes 16S rRNA, OXA-23, OXA-24, OXA-51, OXA-58, IMP, VIM and SIM. The positive amplified products were subjected to DNA sequence analysis. The results showed that the resistant rate of 69 strains to IMP and MEM were 36.2% and 37.68%. The resistant gene was obtained as follows: 69 (100%) carrying OXA-51 gene, 32 (46.4%) carrying OXA-23 gene, 17 (24.6%) carrying OXA-24 gene, 5 (6.8%) carrying OXA-58 genes. Out of 25 carbapenem resistant strains ofA.baumanniiidentified, 22 (88%) carried OXA-23, 1 (4%) carried OXA-58, 10 (40%) carried OXA-24, and 6 (24%) carried both OXA-23 and OXA-24. DNA sequence analysis of OXA-23, OXA-24, OXA-51 and OXA-58 with the NCBI sequence showed 99% homology. Therefore, the OXA-23 gene producer may be responsible for the main reason ofA.baumanniicarbapenemase antibiotic resistance. Moreover, there exists regional epidemic of OXA-24 drug resistant geneA.baumanniiin the hospital.

Acinetobacterbaumannii; carbapenemase; drug resistance; resistant gene；oxacillinase

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(D201224)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(2013-226)；佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(LZZ2014_022)

王曉紅 女，副主任技師。研究方向?yàn)榕R床微生物耐藥機(jī)制的研究。Tel:0454-8606771，E-mail:xiaolizhangcmu@yeh.net

* 通訊作者。女，副教授，博士，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向?yàn)榕R床微生物耐藥機(jī)制的研究。Tel:0454-8801816，E-mail: jmszxl@163.com

2015-03-12；

2015-04-14

Q939.93; R378.991

A

1005-7021(2015)04-0059-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.011