王麗寧， 趙 妍， 陳明杰*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室 國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海 201403)

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香菇單孢雜交及耐高溫雜交子的ISSR分析

王麗寧1, 2， 趙 妍2*， 陳明杰1, 2*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室 國家食用菌工程技術(shù)研究中心，上海 201403)

以香菇菌株L135和P18N44為親本進(jìn)行單孢雜交，通過顯微鏡鏡檢鎖狀聯(lián)合以及與親本的拮抗試驗初步獲得123個雜交子。以47 ℃熱激3 h后菌絲在PDA培養(yǎng)基中的恢復(fù)生長情況進(jìn)行初篩，菌絲在木屑培養(yǎng)基中經(jīng)歷33 ℃高溫后的恢復(fù)長速進(jìn)行復(fù)篩，共篩選獲得耐高溫雜交子12個。選用8條引物對12個耐高溫雜交子和2個親本進(jìn)行了ISSR標(biāo)記分析，結(jié)果表明這12株耐高溫雜交子與親本都存在一定的遺傳差異，說明與親本相比雜交子在基因水平上發(fā)生了不同程度的重組，是新的香菇耐高溫菌株。

香菇；單孢雜交；耐高溫；ISSR分析

香菇(Lentinulaedodes)又名香蕈、香信、冬菇等，隸屬于傘菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、香菇屬(Lentinula)。香菇具有較高的營養(yǎng)價值和藥用功效，其精氨酸、賴氨酸含量豐富，有很好的增智健腦作用；香菇多糖則具有抗腫瘤的作用。因此，香菇素有“菇中之王”的美稱[1]。香菇屬中低溫型食用菌，自然條件下其菌絲的最適生長溫度為24～27 ℃，子實體發(fā)生的最適溫度為15～20 ℃[2]。由于夏季鮮香菇價格高、效益好，其栽培量逐年增長，但香菇菌筒在越夏過程中很難經(jīng)受持續(xù)高溫的考驗，爛筒現(xiàn)象嚴(yán)重，嚴(yán)重影響產(chǎn)量[3]，因此隨著香菇栽培區(qū)域的不斷擴(kuò)大，以及滿足香菇夏季生產(chǎn)的需要，生產(chǎn)者對耐高溫且優(yōu)質(zhì)香菇新品種的需求也越來越大。近年來香菇耐高溫菌種的選育取得了一定的進(jìn)展，福建三明市真菌研究所以香菇95為出發(fā)菌株，用常規(guī)人工選擇育種方式育成的高溫品種L18抗性強(qiáng)、品質(zhì)好，適宜在我國大部分地區(qū)進(jìn)行反季節(jié)覆土栽培[4]；張忠偉等[5]以長白山野生香菇菌株野香3號和生產(chǎn)用品種L66為親本進(jìn)行單孢雜交，經(jīng)4年出菇試驗、產(chǎn)比試驗和生產(chǎn)試驗選育得到的雜交菌株撫香2號出菇期耐高溫，且農(nóng)藝性狀優(yōu)良；麗水市大山菇業(yè)研究開發(fā)有限公司，通過自選分離得到了菇形和菇質(zhì)優(yōu)良的高溫型香菇菌株L9319，目前已成為國內(nèi)夏季鮮香菇生產(chǎn)區(qū)的主栽品種[6]。但耐高溫香菇的品種仍然相對單一，生產(chǎn)實踐中需要更多優(yōu)質(zhì)的耐高溫香菇新品種。目前，國內(nèi)香菇新品種選育應(yīng)用最普遍的方法為雜交育種[7-8]，該方法操作簡便、成功率高。本研究以農(nóng)藝性狀優(yōu)良的菌株L135與耐高溫的誘變菌株P(guān)18N44為親本，借助單孢雜交方法獲得了一批耐高溫的雜交子，并運用ISSR(Inter-simple Sequence Repeat，簡單重復(fù)序列間隔區(qū)標(biāo)記技術(shù))對雜交子的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 香菇菌株L135，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供；P18N44為本實驗室保藏菌種(香菇菌株P(guān)18的耐高溫誘變菌株)。

1.1.2 主要儀器和試劑 智能食用菌培養(yǎng)箱(ZJX-300A，杭州錢江儀器設(shè)備有限公司)；潔凈工作臺(VS-1300L-U，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；顯微鏡(BX60，奧林巴斯光學(xué)有限公司)；PCR儀(Veriti，基因有限公司)；電泳槽(DYY-6C，北京市六一儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國柯達(dá)公司)；TaqDNA polymerase、dNTPs MIX、10×buffer(寶生物工程(大連)有限公司)；Primer(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯提取物200，葡萄糖20，瓊脂20，加蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌15 min；PDY培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯提取物200，葡萄糖20，酵母提取物2，加蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌15 min；木屑培養(yǎng)基：雜木屑78%，麥麩20%，糖1%，石膏1%，料水比1∶1.2～1.3，pH自然，121 ℃滅菌150 min。

1.2 方法

1.2.1 親本單孢菌絲分離 在親本栽培出菇后，選擇菇形圓整、開傘程度七八分的2個親本子實體，在無菌環(huán)境下分別收集其孢子，對收集到的孢子進(jìn)行單孢分離[9]，然后涂布于PDA平板上，待孢子萌發(fā)后，在顯微鏡下觀察，3次鏡檢無鎖狀聯(lián)合的則判定為單孢菌絲，轉(zhuǎn)管擴(kuò)繁備用。

1.2.2 配對雜交及雜交子的檢測 在25 ℃下，將L135的孢子單核體與P18N44的孢子單核體于PDA平板上相聚2 cm進(jìn)行對峙培養(yǎng)，待兩單孢菌落邊緣菌絲彼此接觸3～4 d后，挑取菌落相交處的菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)接。將轉(zhuǎn)接的菌絲用于顯微鏡鏡檢以及與兩親本的拮抗試驗[10]，有鎖狀聯(lián)合且與兩親本發(fā)生拮抗的則初步視為雜交子。

1.2.3 耐高溫雜交子的初篩 對親本菌株L135與P18N44進(jìn)行高溫耐受性試驗，首先將L135與P18N44的平板菌絲用0.5 mm的打孔器打孔后，接種于PDA平板上(各5個平行)，4 d后用記號筆劃出菌絲生長范圍，然后置于47 ℃培養(yǎng)箱中熱激處理3 h。熱處理后的平板轉(zhuǎn)移至25 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察并記錄兩親本熱激后菌絲恢復(fù)生長的情況，以確定兩親本47 ℃熱激3 h后菌絲能夠恢復(fù)生長的天數(shù)，并以此為篩選標(biāo)準(zhǔn)對雜交子進(jìn)行初篩，雜交子中熱激3 h后比親本恢復(fù)快的則初步視為耐高溫雜交子[11-12]。

1.2.4 耐高溫雜交子的復(fù)篩 將1.2.3中篩選到的雜交子于PDA平板上培養(yǎng)5～7 d，用直徑為1 cm的打孔器打孔后，接入裝有木屑培養(yǎng)基的大試管(30 mm×200 mm)中，每個雜交子接5支試管，置于25 ℃培養(yǎng)，待菌絲延伸至木屑中且長勢穩(wěn)定時(大約15 d)，將大試管置于33 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，用記號筆劃線作為起始標(biāo)志，繼續(xù)將大試管置于25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，用記號筆記錄10 d內(nèi)菌絲的生長范圍，計算各雜交子經(jīng)歷33 ℃高溫后菌絲的恢復(fù)生長速度用以作為復(fù)篩的標(biāo)準(zhǔn)，淘汰恢復(fù)長速過慢的雜交子，剩余雜交子用于后續(xù)試驗。

1.2.5 ISSR-PCR分析 將1.2.4得到的雜交子與親本菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，收集菌絲后用CTAB法提取基因組DNA[13]。ISSR-PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系為20 μL，其中10×buffer 2 μL、2.5 mmol/L dNTP 1 μL、10 μmol/L Primer 1 μL、5 U/μLTaqDNA Polymerase 0.2 μL，ddH2O補齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃保持7 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外光下觀察并照相。以親本L135與P18N44的基因組DNA為模板，對16條ISSR引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增，選出能夠清晰、穩(wěn)定地擴(kuò)增出兩親本條帶的引物，再用篩選得到的引物對雜交子和親本進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)，記錄電泳條帶譜圖，并利用軟件NTsys 2.10e構(gòu)建聚類樹狀圖[14-16]。

表1 供試ISSR引物及序列

注：S=(C/G), B=(C/G/T), D=(A/G/T)

2 結(jié)果與分析

2.1 單孢分離及配對雜交

圖1 雜交子84的鎖狀聯(lián)合(A圖中箭頭所示)以及84與親本的拮抗反應(yīng)(B)Fig.1 Clamp connection of hybrid 84 (A indicated by the arrows) and its antagonism reaction with two parents (B)

試驗共得到L135單孢菌株62株，P18N44單孢菌株19株，兩親本單孢菌株隨機(jī)配對208個組合。經(jīng)顯微鏡鏡檢及拮抗試驗，有鎖狀聯(lián)合且與親本產(chǎn)生拮抗的菌株共123株，即初步得到雜交菌株123株，雜交子的鎖狀聯(lián)合及與親本的拮抗反應(yīng)如圖1所示。

2.2 耐高溫雜交子的初篩

根據(jù)實驗室前期的研究基礎(chǔ)[11-12]，對親本菌株L135與P18N44進(jìn)行高溫耐受性試驗。L135于47 ℃熱激3 h后重新置于25 ℃，菌絲經(jīng)7～10 d后能夠恢復(fù)生長；P18N44于47 ℃熱激3 h后菌絲經(jīng)5～7 d能夠恢復(fù)生長。因此以47 ℃熱激3 h后菌絲的恢復(fù)生長天數(shù)少于5 d為標(biāo)準(zhǔn)對2.1中的123株雜交子進(jìn)行篩選(圖2)，初步篩選得到耐高溫雜交子共17株，分別編號為72～88，這17株雜交子于47 ℃熱激3 h后菌絲的恢復(fù)生長天數(shù)都少于5 d，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的恢復(fù)能力，即其耐高溫能力較親本強(qiáng)。

圖2 菌絲于47 ℃熱激3 h后恢復(fù)生長6 d的情況Fig.2 The recover ability of mycelia after being treated at 47 ℃ for 3 h

2.3 耐高溫雜交子的復(fù)篩

王麗寧等[11]的研究表明，經(jīng)歷高溫后木屑培養(yǎng)基中菌絲恢復(fù)長速快的菌株出菇性狀相對較好，又因為香菇菌絲在34 ℃時即會停止生長[2]，因此本研究測定了2.2中17個雜交子及2個親本在木屑培養(yǎng)基中經(jīng)歷33 ℃高溫后的恢復(fù)長速。計算各菌株的恢復(fù)長速(各5個平行)，并統(tǒng)計恢復(fù)長速較快的雜交子(表2)，從統(tǒng)計結(jié)果中可以看出，共有12個雜交子(編號分別為74、75、76、77、79、80、81、82、83、84、85、86)表現(xiàn)出了較快的恢復(fù)長速，初步判斷這12個雜交子為真正的耐高溫雜交子，適合用于后續(xù)的ISSR分析。

表2 親本及雜交子在木屑培養(yǎng)基中的恢復(fù)長速

2.4 ISSR標(biāo)記分析

借助2個親本菌株對16條ISSR引物進(jìn)行篩選，最后得到8條適用引物(ISSR1、ISSR9、ISSR10、ISSR11、ISSR12、ISSR19、ISSR20、ISSR25)，用篩選得到的引物對12個耐高溫雜交子與親本一起進(jìn)行ISSR擴(kuò)增(引物ISSR19的ISSR-PCR擴(kuò)增電泳圖譜如圖3所示)。8條引物共擴(kuò)增出67個條帶，片段大小在200～5 000 bp之間，各條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為6～10個，部分?jǐn)U增片段是所有供試菌株所共有的，說明這些ISSR結(jié)合位點較為保守。依據(jù)上述8條ISSR引物的多態(tài)性數(shù)據(jù)，構(gòu)建12個雜交子與2個親本的UPMGA聚類樹狀圖(圖4)。聚類分析結(jié)果顯示：14株香菇菌株間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.58～0.87，在相似系數(shù)為0.64時分為3個類群。第Ⅰ類群在相似系數(shù)為0.65時又分為2個亞群，第1亞群包括雜交子74、75、82、85、86、83、84和P18N44，第2亞群包括79、80和L135；第Ⅱ類群包括76和77；第Ⅲ類群只包括雜交子81。雜交子與兩親本之間、雜交子之間都存在著一定的遺傳差異。

圖3 引物19的ISSR-PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of ISSR-PCR using primer 19

圖4 ISSR聚類分析圖譜Fig.4 Dendrogram of 14 strains based on ISSR-PCR reaction

3 討 論

雜交育種是遺傳物質(zhì)在細(xì)胞水平上的重組，建立在雙親性狀優(yōu)勢互補的基礎(chǔ)上。雜交育種技術(shù)作為一種較為成熟的育種手段，廣泛應(yīng)用于香菇、平菇等多種食用菌的育種中，已獲得多個優(yōu)良品種和巨大的經(jīng)濟(jì)效益[5，7-9]。本試驗以選育耐高溫香菇新菌株為育種目標(biāo)，采用L135和P18N44作為親本進(jìn)行單孢雜交，通過鏡檢鎖狀聯(lián)合與拮抗試驗初步獲得123株雜交子。目的性狀的篩選是育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，菌絲耐高溫是耐高溫香菇菌株的首要條件。本研究通過菌絲在PDA中的47 ℃熱激試驗進(jìn)行初篩，菌絲在木屑培養(yǎng)基中經(jīng)歷33 ℃高溫后的恢復(fù)長速進(jìn)行復(fù)篩，在比較菌絲的耐熱性后，最終得到了12株耐高溫雜交子。

與常規(guī)的鎖狀聯(lián)合觀察、親本的拮抗試驗不同，分子標(biāo)記則是以生物個體間核苷酸的序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，受外界環(huán)境的影響較小，且能更具體地表征雜交子與親本之間的遺傳信息差異[17]。ISSR作為一種常用的分子標(biāo)記技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于食用菌的種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析[14-16]。本試驗選用條帶清晰、重復(fù)性好的8條引物對12個耐高溫雜交子與2個親本進(jìn)行了ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明在相似系數(shù)為0.64時14個香菇菌株被分成3個類群，雜交子與親本之間都存在著不同程度的遺傳差異，說明與親本相比雜交子在基因水平上發(fā)生了不同程度的重組，是雜交子作為新菌株的有力證據(jù)。

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Monospore Cross-Breeding of Xianggu Mushroom (Lentinula edodes) & ISSR Analysis of Thermo-Tolerant Hybrid

WANG Li-ning1, 2, ZHAO Yan2, CHEN Ming-jie1, 2

(1.Coll.ofFoodSci. &Tech,ShanghaiOceanUni,Shanghai201306; 2.Inst.ofEdibleFungiSAAS,KeyLab.exploitationofSouthernEdibleFungiRes.,Nat'lEngin.Res.Ctr.ofEdibleFungi,Shanghai210403)

Xianggumushroom (Lentinusedodes) strain L135 and P18N44 were taken as parents to carry out monospore cross-breeding. 123 hybrids were obtained initially after observing the existence of clamp connection through microscopic detection and the antagonism experiments with parents. Twelve thermo-tolerant hybrids were obtained after all the hybrids were screened through recover ability of mycelia in PDA after being treated at 47 ℃ for 3 h and mycelia growth rate in sawdust medium during recover process. Eight primers were chosen and used for ISSR mark analysis of 12 thermo-tolerant hybrids and two parents. The results showed that certain genetic differences existed between all these 12 thermo-tolerant hybrids and their parents, indicated that comparing to their parents there were different degree of recombination at gene level had occurred among the 12 thermo-tolerant hybrids, and they were all new thermo-tolerant strains.

xianggumushroom (Lentinulaedodes); monospore cross-breeding; thermo-tolerant; ISSR analysis

國家食用菌產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項目(CARS-24)

王麗寧 女，碩士研究生。研究方向為食藥用菌遺傳育種。E-mail:wanglining90@126.com

* 通訊作者。趙妍 女，博士，助理研究員。研究方向為食用菌遺傳育種與生理生化。E-mail：jiandan289@126.com

2014-11-07；

2014-12-08

Q949.32

A

1005-7021(2015)04-0035-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.04.007

陳明杰 男，博士，研究員。研究方向為食用菌遺傳育種與生理生化。E-mail：mjchen@saas.sh.cn