劉淼清，王永飚，黃曉忠，朱利斌，陳肖鳴，李仲榮

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

體外兩種方式培養(yǎng)的腸神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性比較

劉淼清，王永飚，黃曉忠，朱利斌，陳肖鳴，李仲榮

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

目的：對(duì)纖維連接蛋白（FN）包被和未包被兩種方式培養(yǎng)的腸神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性比較，探索腸神經(jīng)干細(xì)胞體外擴(kuò)增合適的培養(yǎng)方式。方法：從孕15 d SD胎鼠腸管分離出腸神經(jīng)干細(xì)胞，用FN包被和不包被兩種方式原代培養(yǎng)第5天的神經(jīng)球，通過形態(tài)學(xué)、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)其生長(zhǎng)狀態(tài)、增殖及分化能力進(jìn)行比較。結(jié)果：與包被組相比，未包被組的原代培養(yǎng)第5天的神經(jīng)球呈半貼壁生長(zhǎng)，球體形態(tài)較規(guī)則，球體中央開始變黑，神經(jīng)球周邊未形成大量放射狀的神經(jīng)絲；熒光鏡下發(fā)現(xiàn)2組原代神經(jīng)球的Nestin、BrdU都顯陽性；包被組的球體周圍放射狀神經(jīng)絲Tuj-1顯陽性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與包被組的（12.67±2.16）%相比，未包被組的Nestin陽性細(xì)胞百分比顯著增高，為（20.69±2.15）%（P＜0.05）；與包被組的（12.69±1.13）%相比，未包被組的BrdU標(biāo)記的增殖細(xì)胞百分比顯著增加，為（35.82±2.11）%（P＜0.05）；與包被組的（21.77±2.53）%相比，未包被組的Tuj-1陽性細(xì)胞百分比顯著減少，為（10.67±1.14）%（P＜0.05）。結(jié)論：未包被FN的體外培養(yǎng)加快了形成神經(jīng)球的時(shí)間，且形態(tài)較規(guī)則，能較好地維持干細(xì)胞自我增殖，減少分化，適宜作為腸神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖培養(yǎng)方式。

腸神經(jīng)干細(xì)胞；增殖；培養(yǎng)；纖維連接蛋白

位于腸道的腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric neural system，ENS）是獨(dú)立于交感、副交感神經(jīng)的外周自主神經(jīng)系統(tǒng)。國(guó)外研究[1]發(fā)現(xiàn)腸道也存在神經(jīng)干細(xì)胞，即腸神經(jīng)干細(xì)胞（enteric neural stem cells，ENSCs）。在國(guó)內(nèi)，本課題組率先成功提取、培養(yǎng)ENSCs[2]。ENSCs與中樞神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性相比，可能存在對(duì)腸管的特異性，易與ENS結(jié)合、重建，提高移植干細(xì)胞的成活率和移植成功率。因而熟悉、掌握適宜的體外培養(yǎng)ENSCs的方法，對(duì)以后ENSCs的生物學(xué)特性研究、為移植治療提供大量和穩(wěn)定的干細(xì)胞來源有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕15 d（E15）清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量不拘，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK（滬）2007-0005。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)符合動(dòng)物保護(hù)條例并經(jīng)過溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 主要試劑：纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N，Chemicom），DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco），2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，Gibco），Retinoicacid（Sigma），重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（human recombinant bFGF，Sigma），N2/B27-supplement（Gibco），表皮生長(zhǎng)因子（EGF，Sigma），5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU，Sigma）；一抗：小鼠抗大鼠BrdU（CST），小鼠抗大鼠Tuj-1（Abcam），小鼠抗大鼠Nestin（BD）；二抗：DyLight488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（KPL）。

主要儀器：倒置相差顯微鏡（Nikon），熒光顯微鏡（Olympus），流式細(xì)胞儀（BD）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及分組 參照朱利斌等[2-3]建立的大鼠ENSCs分離、培養(yǎng)、純化及鑒定方法并適當(dāng)改良，且培養(yǎng)液中未添加雞胚浸出液（CEE）。方法簡(jiǎn)述如下：孕鼠頸椎脫臼處死，解剖獲得腸管，剪切、消化、過濾、離心后棄去上清，用ENSCs培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，錐蟲藍(lán)染色計(jì)數(shù)，以1.0×106個(gè)/mL接種到預(yù)先用FN包被或未包被的25 mL培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第24小時(shí)半量換液，以后每隔2 d半量，約每5～6 d傳代1次，反復(fù)傳代。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 選取培養(yǎng)5 d的ENSCs作為研究對(duì)象（依據(jù)第5天的ENSCs形成的神經(jīng)球中央開始變黑且需行傳代培養(yǎng)，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)向平臺(tái)期的特點(diǎn)而選?。?。2組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)動(dòng)態(tài)觀察，免疫學(xué)觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，包括Tuj-1陽性細(xì)胞、BrdU標(biāo)記的增殖細(xì)胞、Nestin陽性細(xì)胞百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。陽性細(xì)胞百分比以表示，應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)觀察 FN包被組：原代培養(yǎng)第5天ENSCs腸神經(jīng)球幾乎是貼壁的、不規(guī)則的集落，直徑為100 nm左右，有部分細(xì)胞遷出，集落周圍出現(xiàn)極長(zhǎng)的突觸狀連接（見圖1），經(jīng)免疫學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)集落周圍放射絲狀物Tuj-1顯陽性，提示為神經(jīng)元軸突（見圖3）。腸神經(jīng)球Nestin顯陽性（類似圖4），腸神經(jīng)球BrdU顯陽性。

未包被組：原代培養(yǎng)第5天單細(xì)胞形成典型長(zhǎng)神經(jīng)球，部分懸浮，部分呈半貼壁，背景較干凈，神經(jīng)球間并未出現(xiàn)極長(zhǎng)的神經(jīng)絲，直徑幾乎接近200 nm，球體開始變黑，適宜傳代（見圖2）。腸神經(jīng)球中的細(xì)胞Nestin陽性（見圖4），腸神經(jīng)球BrdU陽性。

圖1 包被組培養(yǎng)第5天ENSCs腸神經(jīng)球貼壁，不規(guī)則，周圍出現(xiàn)極長(zhǎng)的突觸狀連接（×200）

圖2 未包被組第5天ENSCs腸神經(jīng)球，規(guī)則，半懸浮生長(zhǎng)，直徑幾乎接近200 nm（×200）

圖3 包被組ENSCs腸神經(jīng)球周圍放射絲狀物Tuj-1顯陽性

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)2組陽性細(xì)胞百分比 見圖5。與包被組相比，未包被組的Nestin陽性細(xì)胞百分比顯著增加，BrdU標(biāo)記的增殖細(xì)胞百分比顯著增加，Tuj-1陽性細(xì)胞百分比顯著減少（均P＜0.05），見表1。

3 討論

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

表1 2組Nestin、Tuj-1、BrdU陽性細(xì)胞百分比比較（，%）

表1 2組Nestin、Tuj-1、BrdU陽性細(xì)胞百分比比較（，%）

與包被組比：aP＜0.05

組別NestinTuj-1BrdU未包被組20.69±2.15a10.67±1.14a35.82±2.11a包被組12.67±2.16a21.77±2.53a12.69±1.13a

腸神經(jīng)元發(fā)育缺陷性疾病是小兒外科臨床相當(dāng)常見的一類疾病，可以是局限性，也可以為彌漫性，包括先天性巨結(jié)腸、腸神經(jīng)元發(fā)育異常癥等[4]。近年來國(guó)內(nèi)外研究者成功地在胚胎、出生后甚至成年鼠及人的腸道提取、培養(yǎng)出ENSCs[5]。本研究提取同一來源ENSCs，分成用FN包被及未包被2組進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，對(duì)2組ENSCs生物學(xué)特性進(jìn)行全面比較，尋找適宜的培養(yǎng)方式，以易于ENSCs進(jìn)行大量體外擴(kuò)增，便于ENSCs移植治療腸神經(jīng)元發(fā)育缺陷性疾病。

形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)2組細(xì)胞存在共同特點(diǎn)：都能從單細(xì)胞自我增殖形成ENSCs克隆集合體（即腸神經(jīng)球）。但2組從形態(tài)學(xué)及免疫學(xué)方面存在較多不同之處：①相對(duì)于包被組，未包被組ENSCs黏附能力較差，但仍能呈半貼壁狀態(tài)。國(guó)內(nèi)許漢鵬等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腦神經(jīng)干細(xì)胞也存在類似現(xiàn)象，并了解到神經(jīng)前體細(xì)胞在增殖和分化過程中，會(huì)表達(dá)和分泌多細(xì)胞間黏附分子。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室以往研究[7]發(fā)現(xiàn)，來源同體SD胚鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞與ENSCs的生物學(xué)特性存在類似性，推測(cè)ENSCs也可能存在易表達(dá)的黏附因子并分泌黏附蛋白，從而使ENSCs具有黏附性，而半貼壁于瓶底。②未包被組原代培養(yǎng)第5天鏡下背景干凈，克隆球規(guī)則，球體直徑較大。神經(jīng)球是單克隆神經(jīng)干細(xì)胞及其各方向不同分化階段后代細(xì)胞的集合，神經(jīng)球大小反應(yīng)增殖能力大小[8]，說明包被組增殖能力弱于未包被組。③國(guó)外Bondurand等[1]提取E11.5胚鼠消化道神經(jīng)干細(xì)胞并用FN包被培養(yǎng)，培養(yǎng)第10天才能形成典型腸神經(jīng)球，國(guó)內(nèi)肖莉等[9]研究顯示胎齡越小，提取的ENSCs增殖能力越強(qiáng)，E11.5增殖能力強(qiáng)于E15增殖能力。然而本研究E15 ENSCs培養(yǎng)第5天就能形成典型神經(jīng)球，反而E11.5 ENSCs增殖能力弱于E15，說明包被組中FN具有抑制ENSCs增殖的功能。④相對(duì)于未包被組，包被組克隆集合體周圍可見大量神經(jīng)絲出現(xiàn)，經(jīng)免疫學(xué)鑒定為神經(jīng)元特異性β III微管蛋白，此微管蛋白作為分化早期的神經(jīng)元標(biāo)記[7]，說明包被組FN促進(jìn)ENSCs分化為神經(jīng)元等子代細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，未包被組ENSCs表達(dá)Nestin及BrdU標(biāo)記的增殖細(xì)胞含量顯著高于包被組，但BrdU陽性細(xì)胞變化幅度明顯高于Nestin陽性細(xì)胞變化幅度。Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)的一種中間絲狀蛋白-神經(jīng)巢蛋白，目前被公認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞的特征性的生物學(xué)標(biāo)記[7]。Micci等[10]認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)陽性，而祖細(xì)胞表達(dá)陰性，說明Nestin間接反映ENSCs的含量。而BrdU是一種只能在細(xì)胞分裂增殖期摻入到細(xì)胞DNA中的化合物[11]，因此是反映細(xì)胞增殖情況的最佳指標(biāo)。神經(jīng)球是單克隆ENSCs及其各方向不同分化階段后代細(xì)胞的集合[8]，提示BrdU合成量間接反映ENSCs及定向分化的祖細(xì)胞的增殖分裂能力。相對(duì)于Nestin蛋白而言，BrdU指標(biāo)檢測(cè)包括了部分定向增殖分化的祖細(xì)胞，所以比例幅度相對(duì)高于Nestin。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)未包被組Tuj-1陽性細(xì)胞百分比顯著低于包被組，說明與未包被組比，包被組ENSCs增殖能力下降，易分化為神經(jīng)元等子代細(xì)胞。

本研究證實(shí)FN具有抑制ENSCs增殖、誘導(dǎo)ENSCs分化的功能。這一結(jié)果一方面說明無任何底物添加，更能維持ENSCs增殖，減少其分化；另一方面說明這些底物（如FN等）猶如細(xì)胞外基質(zhì)，有助于了解腸道微環(huán)境變化對(duì)腸神經(jīng)系統(tǒng)形成的影響；再者，研究體外藥物干預(yù)對(duì)ENSCs增殖分化影響時(shí)，往往忽略貼壁底物本身會(huì)對(duì)ENSCs分化起重要作用，從而對(duì)研究結(jié)果判定產(chǎn)生偏差。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Comparison of biological properties of enteric neural stem cells in two ways of culturing in vitro

LIU Miaoqing, WANG Yongbiao, HUANG Xiaozhong, ZHU Libin, CHEN Xiaoming, LI Zhongrong. Department of Pediatric Surgery, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To find a suitable proliferation way of culturing enteric neural stem cells in vitro, and to compare the biological characteristics of stem cells which were cultured in dishes coated and uncoated with fibronectin (FN). Methods: Enteric neural stem cells were isloated from gut of 15 days rat embryos, the neurospheres of fifth days were extracted from two groups. Growth status, proliferation and differentiation capacity of cells were compared through morphological observation, immunofluorescence cytochemistry and flow cytometer analysis between the two groups. Results: Compared with the FN coated group, the neurospheres of fifth days were the state of semi-adherent growth, the neurospheral morphology was regular, and were beginning to get dark in the center of them, and the spheres did not form a large amount of nerve fiber. Under fluorescence microscope, the typical neurospheres which were shown positive to BrdU in two groups were found. Radial nerve fiber of the neurospheres were positive to Tuj-1 (neuronal axons). After culturing for 5 days, compared with treatment with FN group (12.67±2.16)%, flow cytometer analysis showed positive to Nestin of the FN uncoated group had inacresed significantly (20.69±2.15)% (P＜0.05); BrdU which mark proliferative cell increased significantly (35.82±2.11)% vs FN group (12.69±1.13)% (P＜0.05); The percentage of Tuj-1 positive to neuron decreased significantly (10.67±1.14)% vs FN group (21.77±2.53)% (P＜0.05). Conclusion: The way of uncoating culture reduces the time of forming neurospheres which were regular shape; maintains stem cell self-proliferation, reduce enteric neural stem cell differentiation and is suitable for stem cell self-proliferation in vitro.

enteric neural stem cells; proliferation; culture; fibronectin

R726.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.005

2014-09-16

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y207272）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺(tái)重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2012ZDA038）。

劉淼清（1984-），男，江西湖口人，住院醫(yī)師，碩士。

李仲榮，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，Email：wmc lzr@163.com。